本发明专利技术公开了一种鸡产蛋下降综合症病毒双抗体夹心ELISA检测方法，具体步骤如下：（1）使用EDS76作为抗原对产蛋鸡和雄性健康成年兔进行免疫，制备鸡抗EDS76血清和兔抗EDS76血清；（2）提纯鸡抗EDS76血清和兔抗EDS76血清中的抗EDS76免疫球蛋白，制得鸡抗EDS76免疫球蛋白和兔抗EDS76免疫球蛋白；（3）ELISA检测步骤；（4）临界值的确定：取X+3S=0.331作为判定的临界值。本发明专利技术既克服了传统方法操作繁琐、耗时费力、检出率低等缺点，又解决了只检查抗体不检查病毒所造成持续性感染动物漏检的问题，其特异性、交叉试验和重复性试验结果表明，它是一种特异、敏感、快速、操作简便的方法。
【技术实现步骤摘要】
一种鸡产蛋下降综合症病毒双抗体夹心ELISA检测方法
本专利技术属于病原检测
，具体涉及一种鸡产蛋下降综合症病毒双抗体夹心ELISA检测方法。
技术介绍
产蛋下降综合综病毒（EDS76）属于腺病毒科腺胸腺病毒属，在临床上可引起鸡、鸭、鹅等家禽的产蛋下降综合征（EggDropSyndrome），所以也叫产蛋下降综合征病毒或者EDS病毒。产蛋下降综合征是1976年荷兰学者VanEck首次报道，所以也称EDS76病毒。1977年分离到病原，现已在英、法、西德、意大利、比利时、西班牙、丹麦、瑞典、挪威、美国、日本、印度等世界上大部分国家发病并分离出病原。EDS76病毒是Ⅲ亚群禽腺病毒的惟一成员，尽管不同的分离毒的限制性核酸内切酶图谱分析有一定差异，该病毒只有一个血清型。在我国1992年李刚首先分离到病毒后，先后从发病鸡群和其他蛋禽类分离到多株病毒。近几年全国疫病普查中，各个地区都有不同程度的阳性感染。近来有关EDS76的研究已经在病原学、流行病学、分子生物学以及作为活载体等方面取得重大的成果。目前对该病毒的检测方法有病毒的分离培养、琼脂扩散试验、中和试验、PCR检测等，病毒分离诊断比较可靠，分离概率低而且耗时费力；琼扩检测简便快速，可是检出率低，容易漏检；中和试验操作复杂，耗时长不能早期诊断；PCR检测的不稳定性、非特异性是一个不容忽视的事实。
技术实现思路
为了解决上述问题，以便于更简便、快速地对大量样品进行EDS76病毒的检测，本专利技术提供一种鸡产蛋下降综合症病毒双抗体夹心ELISA检测方法。本专利技术的目的是以下述方式实现的：一种鸡产蛋下降综合症病毒双抗体夹心ELISA检测方法，具体步骤如下：（1）使用EDS76作为抗原对产蛋鸡和雄性健康成年兔进行免疫，制备鸡抗EDS76血清和兔抗EDS76血清；（2）提纯鸡抗EDS76血清和兔抗EDS76血清中的抗EDS76免疫球蛋白，制得鸡抗EDS76免疫球蛋白和兔抗EDS76免疫球蛋白；（3）ELISA检测步骤：a.将鸡抗EDS76免疫球蛋白用包被液稀释，100μL/孔，37℃下包被120min；b.甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干，每孔加封闭液100μL封闭60min；c.甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干，每孔加待检样品100μL，37℃下作用60min；d.甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干，每孔加稀释好的兔抗EDS76免疫球蛋白100μL，37℃下作用60min；e.甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干，每孔加稀释好的HRP标记的羊抗兔的酶标抗体100μL，37℃作用90min；f.甩弃液体，洗涤液洗板5次，拍干，每孔加TMB显色液100μL，37℃避光作用10min；g.每孔加终止液100μL，小心混匀，用酶标仪测OD450值；（4）临界值的确定用步骤（3）所述的ELISA检测步骤测定30份阴性样品的OD450值，计算测得平均值X为0.280，标准差S=0.017，取X+3S=0.331作为判定的临界值，当被检样品的OD450值≥X+3S时，则判断其为阳性，当被检样品的OD450值＜X+3S时则是阴性。所述步骤（3）的a步骤中，用包被液将鸡抗EDS76免疫球蛋白稀释20-80倍。所述步骤（3）的a步骤中，用包被液将鸡抗EDS76免疫球蛋白稀释40倍，鸡抗EDS76免疫球蛋白的浓度为18μg/mL。所述步骤（3）的b步骤中，用抗体稀释液将兔抗EDS76免疫球蛋白稀释80-200倍。所述步骤（3）的b步骤中，用抗体稀释液将兔抗EDS76免疫球蛋白稀释160倍，兔抗EDS76免疫球蛋白的浓度为8μg/mL。所述步骤（3）的b步骤中的封闭液为质量百分比为1%的BSA-PBST。所述步骤（3）的e步骤中，用抗体稀释液将HRP标记的羊抗兔的酶标抗体稀释4000-6000倍。所述步骤（3）的e步骤中，用抗体稀释液将HRP标记的羊抗兔的酶标抗体稀释5000倍。相对于现有技术，本专利技术建立的从泄殖腔、粪便中检测病毒的夹心间接ELISA方法，筛选的鸡抗EDS76IgG的稀释度是1:40（蛋白含量为18μg/mL）、兔抗EDS76IgG的稀释度是1:160（蛋白含量为8μg/mL），检测标准阳性样品灵敏性达到0.015μg。本专利技术既克服了传统方法操作繁琐、耗时费力、检出率低等缺点，又解决了只检查抗体不检查病毒所造成持续性感染动物漏检的问题，其特异性、交叉试验和重复性试验结果表明，它是一种特异、敏感、快速、操作简便的方法。本专利技术公开了一种鸡产蛋下降综合症病毒双抗体夹心ELISA检测方法，具体步骤如下：（1）使用EDS76作为抗原对产蛋鸡和雄性健康成年兔进行免疫，制备鸡抗EDS76血清和兔抗EDS76血清；（2）提纯鸡抗EDS76血清和兔抗EDS76血清中的抗EDS76免疫球蛋白，制得鸡抗EDS76免疫球蛋白和兔抗EDS76免疫球蛋白；（3）ELISA检测步骤；（4）临界值的确定：取X+3S=0.331作为判定的临界值。本专利技术既克服了传统方法操作繁琐、耗时费力、检出率低等缺点，又解决了只检查抗体不检查病毒所造成持续性感染动物漏检的问题，其特异性、交叉试验和重复性试验结果表明，它是一种特异、敏感、快速、操作简便的方法。具体实施方式本专利技术中所用试剂及其组分如下：包被液：1×碳酸盐缓冲液（100mL，pH=9.6）：Na2CO30.2756g，NaHCO30.6216g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，pH值9.5-9.7，4℃保存；洗涤液：吐温-20与浓度为0.01mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液按照体积比1:2000混合配制而成；PBS溶液：NaCl4.25g，NaH2PO4·2H2O0.178g，Na2HPO4·12H2O1.386g，用蒸馏水溶解并定容至500mL；抗体稀释液：每1LPBS加入Tween-200.5mL，充分混匀；TMB显色液：BufferA：称取66.5063g柠檬酸钾，用800mL四蒸水溶解并用浓盐酸调节pH值至4.0，加入314μLH2O2，用水定容至1L，4℃保存；BufferB：称取0.2956g四甲基联苯胺（TMB），0.0633g四丁基硼氢化铵（TBABH）溶于30mL二甲基乙酰胺（DMA），4℃避光保存；使用时，将BufferA和BufferB以体积比39：1的比例混合，现配现用；3MH2SO4终止液：将浓H2SO4以体积比1:5的比例加入蒸馏水中，混匀冷却至室温即为3M硫酸溶液。减蛋综合征毒株（AV71），购自中国兽医药品监察所；酶标仪购自Biometra公司；酶标抗体、酶标板和HRP标记的羊抗兔酶标抗体购自成都康迪生物有限公司。对产蛋鸡和雄性健康成年兔进行免疫的免疫步骤参考吉林科学技术出版社出版，王世若、王兴龙、韩文瑜主编的现代动物免疫学（第二版），第128-130页。实施例1：1.实验方法1.1EDS76传代增殖培养将减蛋综合征种毒（AV71）毒株用灭菌生理盐水1:10倍稀释，按每毫升100单位加入双抗（青霉素-链霉素溶液），作用15min，每胚0.2mL，置37℃孵化箱内培养。每天照胚两次，弃掉24h内死的胚，将24-96h死亡的鸡胚和96h后的活鸡胚置4℃冰箱过夜，除去气室部位的蛋壳和壳膜，在无菌条件下分别收集尿囊液保存备用。1.2EDS76本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种鸡产蛋下降综合症病毒双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于：具体步骤如下：（1）使用EDS76作为抗原对产蛋鸡和雄性健康成年兔进行免疫，制备鸡抗EDS76血清和兔抗EDS76血清；（2）提纯鸡抗EDS76血清和兔抗EDS76血清中的抗EDS76免疫球蛋白，制得鸡抗EDS76免疫球蛋白和兔抗EDS76免疫球蛋白；（3）ELISA检测步骤：a. 将鸡抗EDS76免疫球蛋白用包被液稀释，100 μL/孔，37 ℃下包被120 min；b. 甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干，每孔加封闭液 100 μL封闭60 min；c. 甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干，每孔加待检样品100 μL，37℃下作用60 min；d. 甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干，每孔加稀释好的兔抗EDS76免疫球蛋白100 μL，37℃下作用60 min；e. 甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干，每孔加稀释好的HRP标记的羊抗兔的酶标抗体100 μL，37℃作用90 min；f. 甩弃液体，洗涤液洗板5次，拍干，每孔加TMB显色液100 μL，37℃避光作用10 min；g. 每孔加终止液100 μL，小心混匀，用酶标仪测OD450值；（4）临界值的确定用步骤（3）所述的ELISA检测步骤测定30份阴性样品的OD450值，计算测得平均值X为0.280，标准差S=0.017，取X+3S=0.331作为判定的临界值，当被检样品的OD450值≥X+3S时，则判断其为阳性，当被检样品的OD450值＜X+3S时则是阴性。...
【技术特征摘要】
1.一种鸡产蛋下降综合症病毒双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于：具体步骤如下：（1）使用EDS76作为抗原对产蛋鸡和雄性健康成年兔进行免疫，制备鸡抗EDS76血清和兔抗EDS76血清；（2）提纯鸡抗EDS76血清和兔抗EDS76血清中的抗EDS76免疫球蛋白，制得鸡抗EDS76免疫球蛋白和兔抗EDS76免疫球蛋白；（3）ELISA检测步骤：a.将鸡抗EDS76免疫球蛋白用包被液稀释，100μL/孔，37℃下包被120min；b.甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干，每孔加封闭液100μL封闭60min；c.甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干，每孔加待检样品100μL，37℃下作用60min；d.甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干，每孔加稀释好的兔抗EDS76免疫球蛋白100μL，37℃下作用60min；e.甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干，每孔加稀释好的HRP标记的羊抗兔的酶标抗体100μL，37℃作用90min；f.甩弃液体，洗涤液洗板5次，拍干，每孔加TMB显色液100μL，37℃避光作用10min；g.每孔加终止液100μL，小心混匀，用酶标仪测OD450值；（4）临界值的确定用步骤（3）所述的ELISA检测步骤测定30份阴性样品的OD450值，计算测得平均值X为0.280，标准差S=0.017，取X+3S=0.331作为判定的临界值，当被检样品的OD450值≥X+3S时，则判断其为阳性，当被检样品的OD450值＜X+3S时则是阴性。2...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏志刚，许贤会，梁桂霞，
申请(专利权)人：河南后羿实业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41
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