一种重组表达质粒、转化子及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种重组表达质粒，还涉及一种含有重组表达质粒的转化子。一种含有重组表达质粒的转化子，所述转化子的宿主菌为蜂房哈夫尼菌，所述重组表达质粒是温控重组表达质粒，所述温控重组表达质粒包含受热不稳定阻遏蛋白调控的启动子和编码多肽的聚核苷酸，该多肽的表达受所述启动子控制。本发明专利技术还涉及该转化子在发酵生产L‑赖氨酸脱羧酶及发酵生产1,5‑戊二胺方面的应用。本发明专利技术解决了现在重组质粒在连续传代中出现不稳定的问题。

Recombinant expression plasmid, transformant and its application

The invention relates to a recombinant expression plasmid, and also relates to a transformant containing recombinant expression plasmid. A transformer containing a recombinant expression plasmid, the host bacteria of which is Hafniella melanogaster, the recombinant expression plasmid is a temperature-controlled recombinant expression plasmid, the temperature-controlled recombinant expression plasmid contains a promoter regulated by a heat-labile repressor protein and a polynucleotide encoding a polypeptide, the expression of which is initiated by the said activation. Subcontrol. The invention also relates to the application of the transformer in the fermentation production of L_lysine decarboxylase and the fermentation production of 1,5_pentylenediamine. The invention solves the problem that the recombinant plasmid is unstable in successive passages.

【技术实现步骤摘要】
一种重组表达质粒、转化子及其应用
本专利技术涉及一种重组表达质粒，还涉及一种含有重组表达质粒的转化子，本专利技术还涉及该转化子的应用，特别是在发酵生产赖氨酸脱羧酶及发酵生产1,5-戊二胺方面的应用。
技术介绍
在以表达重组蛋白为目的的发酵中，通常使用组成型启动子或诱导型启动子(又称可诱导启动子)来启动重组基因的表达。组成型启动子的表达为持续性表达，无需调控。诱导型启动子又分为阻遏型启动子和激活型启动子。阻遏型启动子与阻遏蛋白(或称转录抑制蛋白)结合，受到抑制；在诱导条件下，阻遏蛋白与启动子序列解离，解除抑制。对于阻遏型启动子而言，当阻遏蛋白缺失时，可视为处于持续诱导状态，也可当成组成型启动子。例如lac启动子受阻遏蛋白LacI抑制，是诱导型启动子。但lac启动子在不能表达阻遏蛋白LacI的宿主菌中可以组成型表达。激活型启动子在非诱导条件下不能表达或表达效率低；诱导条件下，激活蛋白被激活，并与激活型启动子结合，促使其表达。例如PBAD启动子受激活蛋白AraC的激活。诱导型启动子又可以分为利用化合物诱导的启动子，如IPTG、单糖或抗生素诱导的启动子，和通过改变培养条件诱导的启动子，如温度诱导的启动子。在大规模的发酵中，向发酵液中添加化合物诱导剂成本巨大。因此利用温控启动子进行重组表达，具有成本上的优势。已公开的热诱导启动子一般受控于一个热不稳定的阻遏蛋白，如TetR的点突变型：G21E，I193N，或A89D(见Wissmann等，“SelectionforTn10repressorbindingtotetoperatorinEscherichiacoli:Isolationoftemperature-sensitivemutantsandcombinatorialmutagenesisintheDNAbindingmotif”，Genetics(1991)Volume128，pp225-232)，LacI的点突变型：S300N或G187S(见Miura-Onai等，“MutationalStudyatSer300positionoftheEscherichiacolilactoserepressor”，BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications(1995)Volume209，Issue1，pp126-30.)，噬菌体λ阻遏蛋白CI(简称λCI)的热不稳定突变型CI857(见Valdez-Crus等，“ProductionofrecombinantproteinsinE.colibytheheatinducibleexpressionsystembasedonthephagelambdapLand/orpRpromoters”，MicrobialCellFactories(2010)9:18)等。λCI的热不稳定突变型还包括：I21S，G53S，A62T，V73A，F141I/P153L，N207T，K224E(见Jana等，“Aminoacidchangesintherepressorofbacteriophagelambdaduetotemperature-sensitivemutationsinitscIgeneandthestructureofahighlytemperature-sensitivemutantrepressor”，ProteinEngineering(1999)Volume12，Issue3，pp225-233)。热不稳定的阻遏蛋白在较低温度下(如30℃或更低)具有抑制转录的活性，而在较高温度下(如42℃)失去抑制活性，因而其所控制的启动子具有热诱导的特性。工业规模的发酵对重组质粒的稳定性有很高的要求。专利CN201210177392.X(公开号CN102851307A，公开日2013-01-02)、US9234203B2(公开日：2016-01-12)首次公开了将重组表达质粒转化进蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei，H.alvei)使之成为成功的工业发酵用重组菌株的技术。US9234203B2披露了，作为宿主菌，蜂房哈夫尼菌与大肠杆菌有一个显著的不同：组成型表达质粒pPlac-cadA在无内源性质粒的大肠杆菌中可以在无抗生素筛选的情况下稳定传代1-2次，但在无内源性质粒的蜂房哈夫尼菌中即使在抗生素筛选条件下也不能稳定传代。为了解决重组质粒不稳定的问题，专利中使用了新型毒素/抗毒素基因对，利用解离后致死机制来提高重组质粒的稳定性。本案专利技术人首次尝试在蜂房哈夫尼菌中使用温控表达的重组质粒，发现当以无内源性质粒的蜂房哈夫尼菌为宿主菌时，温控重组质粒在重组菌正常生长温度下(如35℃)可以在无抗生素筛选的情况下稳定传代至少5次；温控重组质粒在有内源性质粒的蜂房哈夫尼菌中也同样稳定。而在诱导条件下(如42℃)，温控重组质粒的表达效果与pPlac-cadA相当。据此，提出了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一方面目的在于提出一种重组表达质粒，以解决现在重组质粒在连续传代中出现不稳定的问题。一种重组表达质粒，所述重组表达质粒是温控重组表达质粒，所述温控重组表达质粒包含受热不稳定阻遏蛋白调控的启动子和编码多肽的聚核苷酸，该多肽的表达受所述启动子控制。进一步，所述的热不稳定阻遏蛋白包括：热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白CI、热不稳定突变型阻遏蛋白TetR或热不稳定突变型阻遏蛋白LacI；进一步优选地，所述的热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白CI包括CI857，I21S，G53S，A62T，V73A，F141I/P153L，N207T，K224E。又进一步，所述受热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白CI调控的启动子是天然启动子，天然启动子的突变型，或人工构建的启动子；进一步优选地，所述受热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白CI调控的启动子为来源于λ噬菌体基因组的L启动子(简称λPL)、R启动子(简称λPR)、L启动子的突变型、R启动子的突变型。在上述任一技术方案基础上进一步，所述的多肽包括酶或多肽类药物；又进一步优选地，所述的酶包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶中的至少一种，所述多肽类药物包括激素、抗体和生长因子中的至少一种；更进一步优选地，所述裂合酶包括脱羧酶，更进一步优选地，所述脱羧酶包括氨基酸脱羧酶，特别是赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。又更进一步优选地，编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸包括cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段；或者，所述编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸包括如SEQIDNO:1所示的DNA序列、如SEQIDNO:2所示的DNA序列，如SEQIDNO:3所示的DNA序列，如SEQIDNO:1所示序列的片段，如SEQIDNO:2所示序列的片段或如SEQIDNO:3所示序列的片段。本专利技术的第二方面目的在于提出一种含有重组表达质粒的转化子，以解决现在重组质粒在连续传代中出现不稳定的问题。本专利技术通过以下技术方案解决上述技术问题，达到本专利技术的目的。一种含有重组表达质粒的转化子，所述转化子的宿主菌为蜂房哈夫尼菌；所述重组表达质粒是温控重组表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组表达质粒，所述重组表达质粒是温控重组表达质粒，其特征在于，所述温控重组表达质粒包含受热不稳定阻遏蛋白调控的启动子和编码多肽的聚核苷酸，该多肽的表达受所述启动子控制。

【技术特征摘要】
1.一种重组表达质粒，所述重组表达质粒是温控重组表达质粒，其特征在于，所述温控重组表达质粒包含受热不稳定阻遏蛋白调控的启动子和编码多肽的聚核苷酸，该多肽的表达受所述启动子控制。2.根据权利要求1所述的重组表达质粒，其特征在于，所述的热不稳定阻遏蛋白包括：热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白CI、热不稳定突变型阻遏蛋白TetR或热不稳定突变型阻遏蛋白LacI；进一步优选地，所述的热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白CI包括CI857，I21S，G53S，A62T，V73A，F141I/P153L，N207T，K224E。3.根据权利要求2所述的重组表达质粒，其特征在于，所述受热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白CI调控的启动子是天然启动子，天然启动子的突变型，或人工构建的启动子；进一步优选地，所述受热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白CI调控的启动子为来源于λ噬菌体基因组的L启动子、R启动子、L启动子的突变型、R启动子的突变型。4.根据权利要求1-3任一项所述的重组表达质粒，其特征在于，所述的多肽包括酶或多肽类药物；进一步优选地，所述的酶包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶中的至少一种，所述多肽类药物包括激素、抗体和生长因子中的至少一种；又进一步优选地，所述裂合酶包括脱羧酶，更进一步优选地，所述脱羧酶包括氨基酸脱羧酶，又更进一步，所述氨基酸脱羧酶包括赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。5.根据权利要求4所述的重组表达质粒，其特征在于，编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸包括cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段；或者，所述编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸包括如SEQIDNO:1所示的DNA序列、如SEQIDNO:2所示的DNA序列，如SEQIDNO:3所示的DNA序列，如SEQIDNO:1所示序列的片段，如SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：庞振华，周豪宏，刘修才，
申请(专利权)人：上海凯赛生物技术研发中心有限公司，凯赛生物产业有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31