本发明专利技术涉及一种来源于真菌的葡萄糖淀粉酶TlGa15及其基因和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术提供了一个新的葡萄糖淀粉酶基因，其编码的葡萄糖淀粉酶具有良好的性质，可作应用于饲料、食品、医药等工业。因此，本发明专利技术利用基因工程手段生产出了适合工业应用的性质优良的葡萄糖淀粉酶。
Glucoamylase TlGa15 and its gene and Application
The present invention relates to a glucose amylase TlGa15 from fungi and its gene and application. Its amino acid sequence is shown as SEQ ID NO.1 or SEQ ID NO.2. The invention provides a novel glucose amylase gene, which encodes a glucose amylase with good properties and can be used in feed, food, medicine and other industries. Therefore, the invention produces a glucose amylase with excellent properties suitable for industrial application by means of genetic engineering.
【技术实现步骤摘要】
葡萄糖淀粉酶TlGa15及其基因和应用
本专利技术涉及农业生物
，具体地，本专利技术涉及一种来源于真菌葡萄糖淀粉酶TlGa15及其基因和应用。
技术介绍
淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制作业、淀粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。淀粉酶家族包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。α-淀粉酶为内切酶，作用于淀粉分子内部的α-1，4糖苷键，生成糊精和低聚糖。β-淀粉酶为外切酶，它从淀粉非还原性顺次切下麦芽糖。葡萄糖淀粉酶是一种作用于α-1，4糖苷键的外切酶，从非还原糖末端切下葡萄糖分子。葡萄糖淀粉酶底物专一性较低，既能够切断α-1,4-糖苷键，对α-1,6-糖苷键和α-1,3-糖苷键也有轻微的水解能力。葡萄糖淀粉酶是工业上用量最大的生物酶制剂之一，被广泛地应用于食品、医药和发酵等工业，是我国产量和用量最大的生物酶产品之一，具有很高的商业价值。葡萄糖淀粉酶(EC.3.2.1.3)又称糖化酶，是淀粉制糖工业的重要用酶。葡萄糖的工业生产主要分两步：(1)淀粉的液化，在高温α-淀粉酶作用下将糊化的淀粉分解成寡糖和麦芽糖，降低粘度；(2)糖化，液化结束后将温度降至60-65℃，pH调至4.0-4.5，加入适量的葡萄糖淀粉酶保温至葡萄糖浓度达到最高。葡萄糖淀粉酶的作用主要是分解寡糖和麦芽糖，生成葡萄糖。制糖反应中，较高的反应温度有利于整个反应的进行。较高的反应温度更有利于糖化过程进行，主要体现在以下几个方面：(1)高温利于底物溶解，增加底物浓度；(2)降低底物黏度，利于搅拌；(3)降低染菌的风险；(4)增加反应速率，减少反应时间(5)降低酶纯化的成本；(6)延长酶的催化半衰期。当前，工业上应用的糖化酶主要来源于黑曲霉(Aspergillusniger)、泡盛曲霉(Asperillusawamori)和米根霉(Rhizopusoryzae)。淀粉液化的温度通常在95℃条件下进行，第一步在高温条件下进行的，整个反应体系温度较高，因此生产上要求糖化酶也要有较好的温度稳定性，而常见的糖化酶通常只能在60℃下稳定。因此，耐高温糖化酶的选育是本领域亟待解决的问题。
技术实现思路
根据现有技术中淀粉酶热稳定性不好的问题，本专利技术的目的是提供一种酸性、热稳定性提高、适合于在饲料、食品、医药等行业中应用的葡萄糖淀粉酶TlGa15。本专利技术的再一目的是提供上述葡萄糖淀粉酶TlGa15的基因。本专利技术的再一目的是提供包含上述葡萄糖淀粉酶TlGa15的重组载体。本专利技术的再一目的是提供包含上述葡萄糖淀粉酶TlGa15基因的重组菌株。本专利技术的再一目的是提供一种制备葡萄糖淀粉酶TlGa15的方法。本专利技术的再一目的是提供上述葡萄糖淀粉酶TlGa15的应用。根据本专利技术的具体实施方式，葡萄糖淀粉酶TlGa15的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示：该酶全长636个氨基酸，N端20个氨基酸为信号肽序列“MTARLASALCALAFGQAVVA”。根据本专利技术的具体实施方式，成熟的葡萄糖淀粉酶TlGa15氨基酸序列如SEQIDNO.2所示：根据本专利技术的具体实施方式，编码上述葡萄糖淀粉酶的基因序列如SEQIDNO.3所示：根据本专利技术的具体实施方式，葡萄糖淀粉酶基因TlGa15结构基因全长2186bp，含有4个内含子，cDNA长1911bp，其cDNA序列如SEQIDNO.4所示：成熟蛋白理论分子量为65.8kDa，该酶属于糖基水解酶第15家族，一种新的葡萄糖淀粉酶。去除信号肽后的cDNA序列如SEQIDNO.5所示本专利技术还提供了包含上述葡萄糖淀粉酶TlGa15基因的重组载体，优选为pPIC9-TlGa15。将本专利技术的葡萄糖淀粉酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本专利技术的一个最优选的实施方案，优选为将葡萄糖淀粉酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-TlGa15。本专利技术还提供了包含上述葡萄糖淀粉酶TlGa15基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/TlGa15。根据本专利技术的具体实施方式，制备葡萄糖淀粉酶TlGa15的方法包括以下步骤：(1)用上述重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；(2)培养重组菌株，诱导重组葡萄糖淀粉酶TlGa15的表达；(3)以及回收并纯化所表达的葡萄糖淀粉酶TlGa15。根据本专利技术的具体实施方式，所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichiapastoris)细胞、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)细胞。根据本专利技术的具体实施方式，将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichicpastoris)GS115，得到重组菌株GS115/TlGa15。本专利技术的葡萄糖淀粉酶TlGa15最适pH为4.5，在pH4.0-pH5.5范围内，其能够维持其70％以上的酶活力；最适温度75℃，在70℃时依然具有80％以上的酶活力，在65℃下处理60min，剩余酶活在80％以上，在70℃下处理10min，依然能够保持70％的酶活力，具有良好的稳定性。本专利技术的葡萄糖淀粉酶TlGa15可以利用基因工程手段来产业化生产。本专利技术的葡萄糖淀粉酶TlGa15基因可应用于饲料、食品、医药等领域。根据本专利技术的技术方案可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的葡萄糖淀粉酶TlGa15。附图说明图1显示本专利技术的重组葡萄糖淀粉酶TlGa15的最适pH值。图2显示本专利技术的葡萄糖淀粉酶TlGa15的pH稳定性。图3显示本专利技术的葡萄糖淀粉酶TlGa15的最适反应温度。图4显示本专利技术的葡萄糖淀粉酶TlGa15的热稳定性。具体实施方式试验材料和试剂1、菌株及载体：毕赤酵母(PichiapastorisGS115)、毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于生化试剂公司。2、酶类及其它生化试剂：内切酶、连接酶及其它生化试剂均购自试剂公司。3、培养基：(1)产酶培养基：30g/L麦麸，30g/L玉米芯粉，30g/L豆粕，5g/L大麦葡聚糖，5g/L(NH4)SO4，1g/LKH2PO4，0.5g/LMgSO4·7H2O，0.01g/LFeSO4·7H2O，0.2g/LCaCl2于1L去离子水中，121℃，15磅条件下灭菌处理20min(2)大肠杆菌培养基LB(126蛋白胨、0.5％酵母提取物、126NaCl，pH7.0)。(3)BMGY培养基；1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.000049<Biotin，1％甘油(v/v)。(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。实施例1葡萄糖淀粉酶编码基因TlGa15的克隆提取TalaromycesleycettanusJCM12802基因组DNA设计克隆引物，以TalaromycesleycettanusJCM12802总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃5min；94℃30sec,60℃30sec,72℃2min,35个循环，72℃10min，得到约本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种葡萄糖淀粉酶TlGa15，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种葡萄糖淀粉酶TlGa15，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。2.一种葡萄糖淀粉酶TlGa15基因，其特征在于，编码权利要求1所述的葡萄糖淀粉酶TlGa15。3.根据权利要求2所述的葡萄糖淀粉酶TlGa15基因，其特征在于，所述葡萄糖淀粉酶TlGa15基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示。4.包含权利要求2所述葡萄糖淀粉酶TlGa15基因的重组表达载体。5.包含权利要求2所述葡萄糖淀粉酶TlGa15基因的重组表达载体pPIC9-TlGa15。...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗会颖，姚斌，郭玉杰，涂涛，王苑，黄火清，柏映国，苏小运，王亚茹，孟昆，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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