毕赤酵母诱导表达磷脂酶C的方法技术

本发明专利技术提供了一种提高酵母表达外源性蛋白的方法，所述方法包括于32～35℃诱导表达所述外源性蛋白。采用本发明专利技术的方法，能够使得目标蛋白的产量高出低温控制工艺，甚至可高出30‑80％，节能降耗显著，非常容易实现发酵放大和产业化。

Expression of phospholipase C induced by Pichia pastoris

The invention provides a method for improving the expression of exogenous protein in yeast. The method comprises inducing the expression of the exogenous protein at 32 - 35 C. By adopting the method of the invention, the yield of the target protein can be higher than that of the low temperature control process, and even can be increased by 30 80%. The energy saving and consumption reduction are remarkable, and the fermentation enlargement and industrialization can be easily realized.

【技术实现步骤摘要】
毕赤酵母诱导表达磷脂酶C的方法
本专利技术涉及酵母发酵表达外源性蛋白，具体涉及一种能显著提高毕赤酵母诱导表达磷脂酶C产量的方法。
技术介绍
磷脂酶C(phospholipaseC，简称PLC)是一类可催化水解磷脂C3的磷脂酰键的水解酶，在医药、油脂精炼、食品加工、磷脂改性等领域均有广泛应用。而甲醇型毕赤酵母作为磷脂酶C表达的平台，其发酵工艺通常包含三部分，批发酵阶段、甘油补料阶段以及甲醇诱导阶段，其中甲醇诱导阶段的温度控制工艺是影响外源重组蛋白表达产量高低的关键因素之一。据大量的文献报道，毕赤酵母甲醇诱导阶段的诱导温度要低于30℃进行诱导表达，诱导温度一旦高于30℃，会加剧甲醇对细胞的毒害作用，增加了内质网压力，不利于新生肽链的正确折叠，并造成细胞死亡，使得产量急剧下降[1,2,3,4]，因此毕赤酵母诱导表达外源蛋白时通常需要控制在低温条件，常为20-28℃，极个别工艺诱导温度甚至低至12℃，比如重组人复合α干扰素在20℃诱导的单体量和活性分别比30℃的提高7.2倍和38.7倍[5]，HAS-IFN-α2b在20℃诱导的表达量比30℃提高2.16倍[6]，融合南极假丝酵母脂肪酶B在12℃诱导的表达量比30℃提高1倍，菌体死亡率降低66.7％[7]。瑞普酶在20℃诱导的表达量比30℃提高35％，菌体死亡率可降低50.1％[8]，β-木糖苷酶的最佳诱导温度也控制在20℃[9]。由此可见，毕赤酵母表达外源蛋白的特性是需要控制较低的温度才能达到产量最大化，然而毕赤酵母表达外源蛋白的另一特性是高密度培养，细胞干重往往达到了200g/L以上，发酵过程中生成了大量的发酵热，使得在工业规模级别发酵时温度通常难以控制到28℃以下，发酵罐尺度越大，最优温度条件与现实条件这个矛盾越突出，因此一旦从小试放大到生产，一方面温度达不到最优控制条件导致蛋白产量会急剧降低，另一方面为了降低温度会额外消耗大量的冷却水而造成了大量能源浪费，生产成本增加，生产效益变差，这是毕赤酵母表达外源蛋白时所遇到的重大产业化难题。[1]林俊涵.毕赤酵母高密度发酵工艺的研究[J].中国生物工程杂志，2009，29(5)：120-125.[2]钟永军.低温培养增加毕赤酵母的外源蛋白产量的机制研究[D].博士论文，中国科学技术大学，2014.[3]DalyR,HearnMTW.ExpressionofheterologousproteinsinPichiapastoris:ausefulexperimentaltoolinproteinengineeringandproduction[J].JMolRecoginit,2005,18(2):119-138.[4]ZhongY.YangL.etal.High-temperaturecultivationofrecombinantPichiapastorisincreasesendoplasmicreticulumstressanddecreasesproductionofhumaninterleukin-10[J].MicrobCellFact,2014,13:153.[5]史琪琪，郝玉有，吴康华.诱导相温度对毕赤酵母表达重组人复合α干扰素聚合的影响.生物工程学报，2006,22(2)：311-315.[6]ZhaoHL,XueC,WangY,etal.IncreasingthecellviabilityandheterologousproteinproteinexpressionofPichiapastorismutantdeficientinPMR1genebycultureconditionoptimization[J].ApplMicrobiolbiotechnol,2008,81(2):235-241.[7]Jahic,M.Wallberg,F.Bollok,M.etal.Temperaturelimitedfed-batchtechniqueforcontrolofproteolysisinPichiapastorisbioreactorcultures.MicrobCellFact,2003,2(1):6.[8]方曙光，储炬，黄立.温度对巴斯德毕赤酵母表达瑞替普酶(reteplase)的影响[J].工业微生物，2007,37(4):11-15.[9]Dehnavi,E.RanaeiSiadat,S.O.etal.Cloningandhigh-levelexpressionofbeta-xylosidasefromSelenomonasruminantiuminPichiapastorisbyoptimizingofpH,methanolconcentrationandtemperatureconditions[J].ProteinExprPurif,2016,124:55-61.[10]S.Singh,A.Gras,C.F.Vandal,J.Ruprecht,R.Rana,M.Martinez,P.G.Strange,R.Wagner,B.Byrne,Large-scalefunctionalexpressionofWTandtruncatedhumanadenosineA2AreceptorinPichiapastorisbioreactorcultures,Microb.CellFact7(2008)28.
技术实现思路
本专利技术提供了一种提高酵母表达外源性蛋白的方法，能够使得目标蛋白，例如，磷脂酶C的产量高出低温控制工艺，甚至可高出30-80％，节能降耗显著，非常容易实现发酵放大和产业化。本专利技术提供了的提高酵母表达外源性蛋白的方法，包括于32～35℃诱导表达所述外源性蛋白。在本专利技术的一些实例中，所述表达外源性蛋白为通过甲醇诱导表达所述外源性蛋白。在本专利技术的一些实例中，在诱导表达外源性蛋白阶段，控制发酵液的RQ值。在本专利技术的一些实例中，所述控制发酵液的RQ值为当所述发酵液的RQ为0.58-0.60时，进行干预，以降低所述发酵液的RQ值。在本专利技术的一些实例中，所述干预通过降低发酵温度进行干预，优选为降低发酵温度至28-30℃。在本专利技术的一些实例中，所述降低所述发酵液的RQ值为降低所述发酵液的RQ值至0.55-0.56。在本专利技术的一些实例中，所述外源性蛋白为磷脂酶C。在本专利技术的一些实例中，磷脂酶C的序列如SEQIDNO:1所示。在本专利技术的一些实例中，所述酵母为毕赤酵母，优选为GS115，SMD1168，x33，KM71，KM71H，SMD1163及其基因工程菌中的一种或多种。在本专利技术的一些实例中，所述毕赤酵母为表达SEQIDNO:1所示磷脂酶C的菌株，优选为PLC-N63DN131SN134D-Y56H。在本专利技术的一些实例中，所述方法还包括批发酵步骤、甘油补料步骤和饥饿培养步骤中的一个或多个步骤。在本专利技术的一些实例中，所述批发酵步骤包括将所述毕赤酵母菌株于28-30℃，DO％>20％条件下发酵16-26h。在本专利技术的一些实例中，所述甘油补料步骤包括流加甘油使DO为15-30％，培养至菌体湿重200～220g/L。在本专利技术的一些实例中，所述饥饿培养包括使发酵液处于缺少碳源的状态下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高酵母表达外源性蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括于32～35℃诱导表达所述外源性蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种提高酵母表达外源性蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括于32～35℃诱导表达所述外源性蛋白。2.一种通过控制发酵液的RQ值以提高酵母表达外源性蛋白的方法。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述表达外源性蛋白为通过甲醇诱导表达所述外源性蛋白。4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，在诱导表达外源性蛋白阶段，控制发酵液的RQ值。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述控制发酵液的RQ值为当所述发酵液的RQ为0.58-0.60时，进行干预，以降低所述发酵液的RQ值。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述干预为降低发酵温度，优选为降低发酵温度至28-30℃。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述降低所述发酵液的RQ值为降低所述发酵液的RQ值至0.55-0.56。8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述外源性...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨倚铭，吴清杭，关惠琴，常桂芳，
申请(专利权)人：丰益上海生物技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31