一种改善黄素蛋白TrxR纯化的方法技术

一种改善黄素蛋白纯化的方法属于蛋白纯化技术领域。包括：以含有黄素蛋白TrxR的大肠杆菌为原材料，加入TE buffer使菌体充分混匀，再加入溶菌酶37℃作用0.5‑1h，充分破碎细胞得到混合液A，破碎其中核酸，对混合液A进行离心处理得到含有黄素蛋白TrxR的上清液B。将EDTA加入到上清液B中，再将上清液B加入ADP Sepharose亲和层析柱中，洗脱柱子收集洗脱液C，对洗脱液C离心浓缩得浓缩液D。对浓缩液D进行凝胶过滤，收集过滤组分得到纯黄素蛋白TrxR。本发明专利技术简化了黄素蛋白TrxR纯化方法，方法简单，成本低廉，纯化效果较好；EDTA能够保护ADP Sepharose亲和层析配基；具有较高的利用价值。

A method to improve the purification of flavin protein TrxR

A method for improving the purification of flavin protein belongs to the field of protein purification technology. Including: E. coli containing flavin TrxR as raw material, adding TE buffer to make the bacteria fully mixed, and then adding lysozyme at 37 0.5 1 h, the cells were fully broken to get mixed solution A, the nucleic acid was broken, the mixture A was centrifuged to obtain supernatant B containing flavin TrxR. EDTA was added to supernatant B, and then supernatant B was added to ADP Sepharose affinity chromatography column. Eluent C was collected by elution column, and eluent C was centrifuged to concentrate D. The concentrate D was filtrate by gel filtration, and the pure flavin protein TrxR was obtained by collecting the filtration components. The invention simplifies the purification method of flavin TrxR, has the advantages of simple method, low cost and good purification effect; EDTA can protect the affinity chromatography ligand of ADP Sepharose; and has high utilization value.

【技术实现步骤摘要】
一种改善黄素蛋白TrxR纯化的方法
本专利技术属于蛋白纯化
，提供一种改善黄素蛋白TrxR纯化的方法。
技术介绍
哺乳动物硫氧还蛋白还原酶(thioredoxinreductase,TrxR)是黄素蛋白，在生物体的氧化还原平衡中发挥着重要作用，与肿瘤等疾病发病机制密切相关。TrxR是唯一能够还原氧化态硫氧还蛋白(Trx)的酶，通过调控Trx活性和氧化还原状态来调控细胞增殖、活性和凋亡。根据分布位置的不同，TrxR有三种类型，其中位于细胞质和细胞核的是单亚基为55kDa的TrxR。对于黄素蛋白的分离纯化，王敏等采用HiTrapChealtingHP柱一步亲和层析法分离纯化亚硫酸还原酶的α亚基黄素蛋白(cysJ)，cysJ酶回收率为12.15％(王敏,曾嘉,黄霞等.嗜酸氧化亚铁硫杆菌亚硫酸还原酶的α亚基黄素蛋白(cysJ)的表达、纯化及活性测定[J].现代生物医学进展,2008,8(3):453-455.)。刘辉等通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换柱、Toyopearl疏水层析柱和SephadexG-75分子筛层析纯化得到肌氨酸氧化酶，得率为22.3％(刘辉,孙桂琴,马晓航,等.芽胞杆菌BSD-8肌氨酸氧化酶的纯化与性质[J].生物工程学报,2010,26(3):335-340.)。陈文波等通过硫酸铵盐析、DEAE-SepharoseFastFlow弱阴离子交换凝胶色谱柱层析、Blue-Sepharose亲和色谱柱层析、ResourceQ强阴离子交换色谱柱层析和Superdex200prepgrade凝胶过滤色谱柱层析等方法从猪脑中分离并纯化TrxR，最终产率仅为13.9％(陈文波等,猪脑中硫氧还蛋白还原酶的纯化与表征.安徽农业科学,2013(18):第7832-7835页)。综上所述，我们可以知道，在黄素蛋白的分离纯化中，大多采用硫酸铵分级沉淀、亲和层析、离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤等一种或多种方法联用的策略制备黄素蛋白纯品。黄素蛋白的分离纯化策略多种多样，为了得到黄素蛋白纯品，需要两步或者更多步骤的策略，过程繁琐。而且这些分离纯化策略普遍存在黄素蛋白收率低等问题。
技术实现思路
针对现有纯化技术中黄素蛋白TrxR收率低和成本高的问题，本专利技术提供一种改善黄素蛋白TrxR纯化的方法。2’5’ADPSepharose亲和层析与SephacrylS-300凝胶过滤联用纯化黄素蛋白TrxR。通过改进工艺提高了黄素蛋白TrxR的收率，用高性价比的SephacrylS-300替代价格高昂的Superdex200凝胶过滤柱进行TrxR的精细分离纯化，极大降低了整个黄素蛋白TrxR纯化工程的成本。为了达到上述目的，本专利技术的技术方案为：一种改善黄素蛋白TrxR纯化的方法，包括以下步骤：(1)以含有黄素蛋白TrxR的大肠杆菌为原材料，每1g质量的大肠杆菌湿菌体加入4-9mlTEbuffer(Tris-EDTA缓冲液)使菌体充分混匀得到混合液，再加入溶菌酶使混合液中溶菌酶终浓度为50μg/ml，37℃作用0.5-1h，反复冻融三次，充分破碎细胞得到混合液A。采用超声破碎仪破碎混合液A中核酸。在4℃，13000rpm/min的条件下，采用离心机对混合液A进行离心处理20min，得到含有黄素蛋白TrxR的上清液B。(2)将EDTA(乙二胺四乙酸)加入到上清液B中，使上清液B中EDTA的终浓度为20mM，用于保护ADP配基，提高黄素蛋白TrxR的ADPSepharose亲和层析收率。再将上清液B加入2’5’ADPSepharose亲和层析柱中，采用TEbuffer清洗柱子。接着采用TE+0.5MNaCl洗脱柱子，收集洗脱液C。最后采用截留分子量为30kDa的超滤离心管对洗脱液C离心浓缩得浓缩液D。(3)在start层析系统上对浓缩液D进行SephacrylS-300(聚丙烯酰胺葡聚糖)凝胶过滤，以TE+0.15MNaCl为流动相，用UV280nm监测凝胶过滤过程中蛋白含量变化，收集过滤组分，得到纯黄素蛋白TrxR。优选地，所述方法步骤(1)中超声破碎仪破碎混合液A中核酸的方法是冰上操作，70％振幅，开2s停3s，工作2min。优选地，所述方法步骤(2)中上清液B的2’5’ADPSepharose亲和层析过程为两个柱体积(CV)上样，20CVTEbuffer清洗非特异性结合在配基上的杂蛋白，3CVTE+0.5MNaCl洗脱特异性结合在ADP配基上的TrxR。优选地，所述方法步骤(3)中使用高性价比的SephacrylS-300凝胶过滤柱进一步精细纯化黄素蛋白TrxR。相比现有技术，本专利技术具有以下有益效果：(1)黄素蛋白TrxR纯化方法简便，仅采用2’5’ADPSepharose亲和层析和SephacrylS-300凝胶过滤的方法，SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)电泳分析显示为单一条带，说明纯化效果好。(2)通过向上清液B中补充终浓度为20mM的EDTA，有效提高了黄素蛋白TrxR的总收率，TrxR总收率达到77％。(3)用高性价比的SephacrylS-300替代价格高昂的Superdex200凝胶过滤柱进行黄素蛋白TrxR的进一步精细分离纯化，极大降低了整个黄素蛋白TrxR纯化工程的成本。附图说明图1是上清液B中不同EDTA浓度对TrxR的2’5’-ADPSepharose亲和层析收率的影响；图2是SephacrylS-300凝胶过滤色谱图，UV280nm吸光度曲线代表蛋白含量的变化。具体实施方式结合实施例详细阐述本专利技术的具体实施方式如下：对比例1将2L含有黄素蛋白TrxR的大肠杆菌菌液低速离心收集到约7g湿菌体，加入50mlTEbuffer使菌体充分混匀，加入50μl浓度为50mg/ml的溶菌酶，37℃作用0.5h，反复冻融三次，充分破碎细胞得到混合液A。使用超声破碎仪冰上操作，70％振幅，工作2s停止3s，持续2min破碎混合液A中核酸。使用离心机，4℃、13000rpm离心混合液A20min，获得50ml含有黄素蛋白TrxR的上清液B。每次取5ml上清液B上样进5ml柱体积的2’5’ADPSepharose亲和层析柱1中，用100mlTEbuffer清洗柱子，接着用15mlTE+0.5MNaCl洗脱柱子，收集到15ml洗脱液C。共进行10次亲和层析，得到150ml洗脱液C。使用截留分子量为30kDa的超滤离心管对洗脱液C离心浓缩得0.95ml浓缩液D。在start系统上对浓缩液D进行SephacrylS-300凝胶过滤，以120mlTE+0.15MNaCl为流动相，用UV280nm监测凝胶过滤过程中蛋白含量变化，收集过滤组分，得到纯黄素蛋白TrxR。用DTNB法对上清液B和最终的纯黄素蛋白TrxR进行动力学测试，计算总活力，得到TrxR的终收率为44％。实施例2将2L含有黄素蛋白TrxR的大肠杆菌菌液低速离心收集到约7g湿菌体，加入60mlTEbuffer使菌体充分混匀，加入60μl50mg/ml的溶菌酶，37℃作用0.8h，反复冻融三次，充分破碎细胞得到混合液A。使用超声破碎仪冰上操作，70％振幅，工作2s停止3s，持续2min破碎混合液A中核酸。使用离心机，4℃，13000rpm离心混合液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种改善黄素蛋白TrxR纯化的方法，其特征在于以下步骤：(1)以含有黄素蛋白TrxR的大肠杆菌为原材料，每1g质量的大肠杆菌湿菌体加入4‑9ml TE buffer缓冲液使菌体充分混匀得到混合液；再加入溶菌酶，使混合液中溶菌酶的最终浓度为50μg/ml，37℃作用0.5‑1h，反复冻融三次，充分破碎细胞得到混合液A；采用超声破碎仪破碎混合液A中核酸；采用离心机对混合液A进行离心处理，得到含有黄素蛋白TrxR的上清液B；(2)将乙二胺四乙酸EDTA加入上清液B中，使上清液B中EDTA的终浓度为20mM；再将上清液B加入ADP Sepharose亲和层析柱中，采用TE buffer清洗柱子；接着采用TE+0.5M NaCl洗脱柱子，收集洗脱液C；最后采用截留分子量为30kDa的超滤离心管对洗脱液C离心浓缩得浓缩液D；(3)在

【技术特征摘要】
1.一种改善黄素蛋白TrxR纯化的方法，其特征在于以下步骤：(1)以含有黄素蛋白TrxR的大肠杆菌为原材料，每1g质量的大肠杆菌湿菌体加入4-9mlTEbuffer缓冲液使菌体充分混匀得到混合液；再加入溶菌酶，使混合液中溶菌酶的最终浓度为50μg/ml，37℃作用0.5-1h，反复冻融三次，充分破碎细胞得到混合液A；采用超声破碎仪破碎混合液A中核酸；采用离心机对混合液A进行离心处理，得到含有黄素蛋白TrxR的上清液B；(2)将乙二胺四乙酸EDTA加入上清液B中，使上清液B中EDTA的终浓度为20mM；再将上清液B加入ADPSepharose亲和层析柱中，采用TEbuffer清洗柱子；接着采用TE+0.5MNaCl洗脱柱子，收集洗脱液C；最后采用截留分子量为30kDa的超滤离心管对洗脱液C离心浓缩得浓缩液D；(3)在start层析系统上对浓缩液D进行聚丙烯酰胺葡聚糖SephacrylS-300凝胶过滤，以TE+0.15MNaCl为流动相，用UV280nm监测凝胶过滤过程中蛋白含量...

【专利技术属性】
技术研发人员：许建强，张竞争，徐卫平，孙世博，关水，马昆，薛宏宇，王晓晓，张楠，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21