一种抗猪流行性腹泻病毒S1蛋白杂交瘤细胞株的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种抗猪流行性腹泻病毒S1蛋白杂交瘤细胞株的制备方法，该由方法由以下步骤组成：(1)哺乳细胞表达的重组猪流行性腹泻病毒S1蛋白与206佐剂1：1充分混合后注射BALB/c小鼠，5μg/只。分别在首免后14d和35d进行两次加强免疫，采用206佐剂，剂量仍为5μg/只；(2)ELISA方法测定血清抗体滴度高于1：105的小鼠采集脾B淋巴细胞与杂交瘤细胞进行融合，挑选阳性克隆后进行亚克隆得到所述的抗猪流行性腹泻病毒S1蛋白杂交瘤细胞株。本方法所制备的杂交瘤细胞株可表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体可用于检测猪流行性腹泻病毒。

Preparation method of hybridoma cell line S1 * against porcine epidemic diarrhea virus

【技术实现步骤摘要】
一种抗猪流行性腹泻病毒S1蛋白杂交瘤细胞株的制备方法
本专利技术属于细胞工程与免疫学领域，具体涉及表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
技术介绍
猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea)由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus)引起，临床上以猪的急性肠炎、呕吐、水样腹泻、脱水以及哺乳仔猪的高死亡率为特征1978年本病首次发生于比利时和英国。1984年，宣华等通过荧光抗体试验和血清中和试验证实该病在我国的存在。目前世界上许多主要养猪国家都有该病的报道，尤其以欧洲和亚洲最为严重。S蛋白是位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白，属于1型跨膜糖蛋白，由4部分组成，分别是信号肽区(1-18aa)、4个中和表位(499-638aa、748-755aa、764-771aa和1368-1374aa)、1个跨膜接构域(1334-1356aa)以及1个短的胞浆区。通过比较与其他冠状病毒S蛋白的同源性，也可将PEDVS蛋白分为S1(1-789aa)和S2(790-1383aa)两个接构域。S蛋白以三聚体的形式存在于病毒囊膜表面，参与病毒与宿主细胞的吸附和融合，同时它也是诱导宿主产生中和抗体的主要抗原分子。另外，S蛋白与病毒的细胞适应性和病毒毒力有关。因此，S蛋白是开发PEDV疫苗的重要靶点。目前猪流行性腹泻病毒血清学检测方法研究进展较慢，主要原因在于该病毒的实验室培养较为困难，且原核表达的蛋白由于不具备翻译后修饰过程，因此原核表达的重组蛋白制备的单克隆抗体检测天然蛋白时出现假阴性几率较高，因此很难在临床上进行推广。本专利技术在获得哺乳细胞表达的猪流行性腹泻病毒S1蛋白的基础上，免疫小鼠制备单克隆抗体，为猪流行性腹泻病毒血清学检测方法的建立奠定基础。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供一种抗猪流行性腹泻病毒S1蛋白杂交瘤细胞株的制备方法，该方法所制备的杂交瘤细胞株可表达用于检测猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体。本专利技术所解决的技术问题采用的技术方案是：一种抗猪流行性腹泻病毒S1蛋白杂交瘤细胞株的制备方法，该由方法由以下步骤组成：(1)哺乳细胞表达的重组猪流行性腹泻病毒S1蛋白与206佐剂1：1充分混合后注射BALB/c小鼠，5μg/只。分别在首免后14d和35d进行两次加强免疫，采用206佐剂，剂量仍为5μg/只；(2)ELISA方法测定血清抗体滴度高于1：105的小鼠采集脾B淋巴细胞与杂交瘤细胞进行融合，挑选阳性克隆后进行亚克隆得到所述的抗猪流行性腹泻病毒S1蛋白杂交瘤细胞株。本专利技术还提供一种表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体由上述方法得到的抗猪流行性腹泻病毒S1蛋白杂交瘤细胞株表达。其中，所述单克隆抗体为IgG2b的亚型，轻链为κ链。本专利技术还提供一种检测猪流行性腹泻病毒的间接免疫荧光试剂盒，该间接免疫荧光试剂盒含有上述单克隆抗体。本专利技术所取得的技术效果如下：(1)现有技术大多采用原核表达或酵母表达蛋白，上述方法制备的蛋白与天然蛋白在高级结构方法存在较大差异，上述表达系统表达的蛋白制备的单克隆抗体效果较差，本专利技术所选用的哺乳细胞表达的猪流行性腹泻病毒S1蛋白，该蛋白接近病毒蛋白的天然构象与修饰加工，抗原性好；(2)本专利技术提供的单克隆杂交瘤细胞表达的单克隆抗体能结合重组表达的S1蛋白和猪流行性腹泻病毒天然S1蛋白；(3)本专利技术提供的单克隆抗体可用于猪流行性腹泻病毒血清学检测，包括ELISA，Westernblot和间接免疫荧光检测方法。(4)本专利技术采用206佐剂乳化重组蛋白，能显著降低抗原需要量。附图说明图1为12D14H4单克隆抗体纯化产物还原性SDS-PAGE鉴定图。图2为基于12D14H4单克隆抗体的PEDV病毒Westernblot检测方法的结果图。图3为基于12D14H4单克隆抗体建立PEDV间接免疫荧光检测方法的结果图。图4为PEDV间接免疫荧光检测方法灵敏性评价图。图5为PEDV间接免疫荧光检测方法特异性评价图。上述图1至5中，图中标注符号的含义分别是：图1中，A为12D14H4单克隆抗体纯化产物，B为蛋白marker；图2中，A为未感染PEDV的Vero细胞冻融上清，B为感染PEDV的Vero细胞冻融上清；图3中，A为感染PEDV病毒的Vero细胞12D14H4标记抗体检测，B为未感染病毒的Vero细胞；图4中，A为100倍稀释酶标抗体，B为500倍稀释酶标抗体，C为1000倍稀释酶标抗体，D为2000倍稀释酶标抗体，E为4000倍稀释抗体，F为8000倍稀释抗体，G为阴性对照；图5中，A为PEDV病毒感染Vero细胞，B为猪瘟病毒感染Vero细胞，C为猪伪狂犬病毒感染Vero细胞，D为猪蓝耳病毒感染的Vero细胞，E为猪圆环病毒2型感染的Vero细胞，F为猪细小病毒感染的Vero细胞。具体实施方式结合具体实施例对本专利技术做进一步地描述，但具体实施例并不对本专利技术做任何限定。实施例所涉及的材料及其来源如下：哺乳细胞表达的猪流行性腹泻病毒S1蛋白由广州伯尼兹生物科技有限公司保存；猪流行性腹泻病毒由广州伯尼兹生物科技有限公司保存；预染蛋白Marker购自SunShineBio公司；牛血清白蛋白和琼脂糖购自Amresco公司；二氨基联苯胺购自上海迈瑞尔化学技术有限公司；二甲基亚砜0.25％胰蛋白酶、DMEM培养基及南美胎牛血清为Hyclon公司产品。实施例1(单克隆抗体的制备与鉴定)1单克隆PEDV-12D14H4的制备1.1重组猪流行性腹泻病毒S1抗原制备哺乳细胞表达的猪流行性腹泻病毒S1蛋白为广州伯尼兹生物科技有限公司保存，与206佐剂充分混合，抗原浓度为25μg/ml。1.2免疫小鼠第一次免疫：取重组抗原与等体积的206佐剂混匀后，以每只5μg/200μl的量皮下注射BALB/c小鼠；第二次免疫：隔2周后，取重组抗原与等体积的206佐剂混匀后，以每只5μg/200μl的量多点皮下注射BALB/c小鼠；第三次免疫:再隔2周后，取重组抗原与等体积的PBS混匀后，以每只5μg/200μl的量皮下注射BALB/c小鼠；第三次免疫10天后小鼠尾静脉取血，以重组抗原包被，ELISA检测血清效价，取效价大于1:105的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合；1.3免疫血清效价测定采用间接ELISA法测定免疫血清效价。取100μg重组猪流行性腹泻病毒S1蛋白溶解于10ml0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液，包被96孔酶标板，100μl/孔，4℃过夜。次日，使用PBST洗板三次，小鼠于第三次免疫后15天眼眶采血，鼠免疫血清用含1％BSA10mMPBS以10-1-10-8倍稀释，加入96孔板，100μl/孔37℃1h，PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次后，加入1:1000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(Sigma，INC)，100μl/孔37℃1h，同上洗板后，TMB显色，100μl/孔，室温避光10min，加100μl/孔2MH2SO4终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与対照值的比≥2.1为阳性来判断免疫血清的效价。2杂交瘤的制备取血清效价大于1：105的小鼠，融合前3天，取重组抗原与本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗猪流行性腹泻病毒S1蛋白杂交瘤细胞株的制备方法，该由方法由以下步骤组成：(1)哺乳细胞表达的重组猪流行性腹泻病毒S1蛋白与206佐剂1：1充分混合后注射BALB/c小鼠，5μg/只。分别在首免后14d和35d进行两次加强免疫，采用206佐剂，剂量仍为5μg/只；(2)ELISA方法测定血清抗体滴度高于1：105的小鼠采集脾B淋巴细胞与杂交瘤细胞进行融合，挑选阳性克隆后进行亚克隆得到所述的抗猪流行性腹泻病毒S1蛋白杂交瘤细胞株。

【技术特征摘要】
1.一种抗猪流行性腹泻病毒S1蛋白杂交瘤细胞株的制备方法，该由方法由以下步骤组成：(1)哺乳细胞表达的重组猪流行性腹泻病毒S1蛋白与206佐剂1：1充分混合后注射BALB/c小鼠，5μg/只。分别在首免后14d和35d进行两次加强免疫，采用206佐剂，剂量仍为5μg/只；(2)ELISA方法测定血清抗体滴度高于1：105的小鼠采集脾B淋巴细胞与杂交瘤细胞进行融合，挑选阳性克隆后进行亚克隆得到所述的抗猪流行性腹泻...

【专利技术属性】
技术研发人员：李红卫，刘军，仇珍珍，梁文翰，许明宇，武望盛，陈晃耀，万鹏飞，王升尧，颜仁和，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44