一种基于微纳米球腔阵列的单细胞定位与筛选的生物芯片及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种基于微纳米球腔阵列的单细胞定位与筛选的生物芯片及其制备方法，属于生物芯片技术领域；由氧化铟锡基底与微球腔碗状结构的上层单元组成，氧化铟锡基底透明且具有良好的导电性，微球腔碗状结构的上层单元是多个微纳米球腔形成的独立的隔离单元阵列，微纳米球腔的材料为三氧化二铝，微纳米球腔的底部基底裸露。本发明专利技术以微球腔阵列生物芯片技术为基础，将其整合于单细胞定位与筛选应用，有效的降低了单细胞定位与筛选的操作难度，规范了操作流程，并有利于后期检测分析的开展。该芯片化的检测方案简洁，高效，成本低廉。对于细菌细胞的定位与筛选具有广泛的应用价值。

A single cell localization and screening biochip based on micro nano sphere array and its preparation method

The invention relates to a single cell localization and screening biochip based on micro-nano spherical cavity array and a preparation method thereof, belonging to the technical field of biochip, which is composed of an indium tin oxide substrate and an upper layer of a bowl-like structure of a microsphere cavity, an indium tin oxide substrate having transparent and good conductivity, and an upper layer of a bowl-like structure of a microsphere cavity. The unit is an independent array of isolation units formed by several micro-nano sphere cavities. The material of the micro-nano sphere cavity is aluminum oxide, and the substrate of the micro-nano sphere cavity is exposed. The invention integrates the microcapsule cavity array biochip technology into the application of single cell localization and screening, effectively reduces the operation difficulty of single cell localization and screening, standardizes the operation process, and is conducive to the development of late detection and analysis. The chip detection scheme is simple, efficient and low cost. It has broad application value for the location and screening of bacterial cells.

【技术实现步骤摘要】
一种基于微纳米球腔阵列的单细胞定位与筛选的生物芯片及其制备方法
本专利技术涉及一种生物芯片及其制备方法，特别涉及一种基于微纳米阵列球腔状结构的生物芯片及其制备和应用方法，应用于单细胞高通量定位与筛选。它可以用来筛选特异工业菌株、检测蛋白质等生物大分子，能够广泛的应用于药物筛选、微生物鉴定、核算和蛋白功能分析等领域；属于生物芯片

技术介绍
随着生命科学的发展，生物芯片研究成为热点。生物芯片又称蛋白芯片或基因芯片，它们起源于DNA杂交探针技术与半导体工业技术相结合的结晶。该技术是将大量探针分子固定于支持物上后与带荧光标记的DNA或其他样品分子(例如蛋白、因子或小分子)进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品的数量和序列信息。生物芯片的主要特点能够实现高通量信息筛选与分析，微型化体积有利于试剂用量的减少，节约成本，快速、高效、灵敏的处理与分析生物信号。其中，高通量定位与筛选是生物芯片实现技术提升的关键。以微板形式作为实验工具载体，实现分子水平和细胞水平的实验研究，是实现微量化生物芯片的重要方法。目前，利用生物芯片，借助高通量定位与筛选，实现单细胞分析一直是国内外研究的一个热点，并且已经渗入到众多相关性学科的研究中。常见的单细胞定位与筛选的制备方法有微流道捕获法、T型液滴形成法、微接触打印法等。但这些方法实现单细胞的定位与筛选仅限于大尺寸细胞的研究，小尺寸细胞例如细菌很难实现精确地筛选与定位分析。并且，常用的技术方法的制备成本较高、工艺复杂。相对于其他的结构模式，微阵列式生物芯片应用于单细胞的高通量定位与筛选具有显著的优势：第一，阵列结构的规则有序，便于位置的编码，实现精准的定位。对于细菌的定位具有很好的应用。第二、采用微阵列作为载体可以利用一些其他辅助手段如超声、震荡等实现细胞均匀分散在阵列结构中，避免了细胞团聚现象，有利于实现单细胞的分散。第三、微结构表面修饰生物相容性分子，保证了细菌的生存及生长环境，有利于对生物信息分子的提取与分析。因此，利用阵列微结构实现单细胞的高通量定位与筛选是制备生物芯片的关键。鉴于阵列微结构的规则有序特性，开发具有阵列微结构的生物芯片，是实现单细胞高通量筛选的简便而有效途径。同时，实现微结构的微米甚至纳米级的尺寸结构设计为生物芯片器件组装提供了研究基础，并将进一步扩大生物芯片点的应用范围，提高高通量定位与筛选的精度。最近几年阵列微结构的生物芯片吸引了越来越多研究中的兴趣，并有望成为药用化学、分子生物学、微生物学等领域研究的新热点。为了能够实现更多的应用范围，制备小尺寸的阵列微结构是实现生物芯片应用于单细胞定位与筛选的必然趋势。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是解决现有生物芯片技术实现单细胞定位与筛选中存在的问题，提供一种应用于单细菌细胞的定位与筛选的微纳米球腔阵列的单细胞定位与筛选的生物芯片。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案达到的：一种基于微纳米球腔阵列的单细胞定位与筛选的生物芯片，由氧化铟锡(ITO)基底与微球腔碗状结构的上层单元组成，氧化铟锡(ITO)基底透明且具有良好的导电性，微球腔碗状结构的上层单元是多个微纳米球腔形成的独立的隔离单元阵列，微纳米球腔的材料为三氧化二铝，微纳米球腔的底部基底裸露。优选地，所述微纳米球腔阵列具有可以通过光纤光谱仪扫描阵列排序，形成编码阵列，用于单细胞细菌的定位与筛选。优选地，所述的单细胞为细菌细胞。优选地，所述的ITO玻璃基底的厚度0.8cm，尺寸1.5cm*2cm。优选地，所述的ITO的导电率8-12/sq。优选地，所述微纳料球腔的内径1.8μm-2μm，高度1μm-1.2μm之间。优选地，所述的微纳料球腔阵列长1.8cm，宽1.5cm。本专利技术的另一目的是提供一种上述基于微纳米球腔阵列的单细胞定位与筛选的生物芯片的制备方法。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案达到的：一种上述基于微纳米球腔阵列的单细胞定位与筛选的生物芯片的制备方法，其步骤如下：(1)氧化铟锡玻璃，用王水浸泡，去离子水清洗干净；(2)将清洗干净的氧化铟锡玻璃，浸泡在十二烷基硫酸钠中，静止吸附，增加氧化铟锡玻璃的亲水性，氧化铟锡玻璃用氮气吹干待用；(3)选取聚苯乙烯微球，配置成无水乙醇和去离子水的10wt％悬浊液，震荡混合均匀；(4)利用自组装法，在氧化铟锡玻璃上自组装单层聚苯乙烯微球薄膜阵列；(5)在聚苯乙烯微球薄膜阵列上利用原子层沉积技术，沉积生长三氧化二铝，利用电感耦合刻蚀技术，对沉积后的聚苯乙烯微球薄膜阵列刻蚀，制备成完整地碗状结构，形成微纳米碗阵列。优选地，所述步骤(1)中所述十二烷基硫酸钠的浓度为10wt％。优选地，所述步骤(2)中所述静止吸附为2h。优选地，所述步骤(3)中所述聚苯乙烯微球的粒径为2μm。优选地，所述步骤(3)中所述无水乙醇和去离子水的配比为2：1。优选地，所述步骤(5)中所述刻蚀时间为5min，ICP功率400，RF功率100。优选地，所述步骤(5)中所述三氧化二铝的厚度为80nm。本专利技术的再一目的是提供一种上述基于微纳米球腔阵列的单细胞定位与筛选的生物芯片的应用方法。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案达到的：一种上述基于微纳米球腔阵列的单细胞定位与筛选的生物芯片的应用方法，其步骤如下：(1)对微纳米球腔阵列进行灭菌处理，将微纳米球腔阵列浸泡在乙醇中以去除杂菌污染；用缓冲液浸泡微纳米球腔阵列，增加微纳米球腔阵列的生物相容性；(2)取微量已经分散处理的细菌菌液，直接放置在步骤(2)处理后的微纳米球腔阵列上，室温静止等待；并用磷酸缓冲液(PBS)冲洗微纳米球腔阵列外多余的细菌；(3)用倒置荧光显微镜观察细菌阵列，检测结果。优选地，所述步骤(1)中所述在乙醇中的浸泡时间为30min。优选地，所述步骤(1)中所述缓冲液为磷酸缓冲液(PBS)，pH为7.4，在磷酸缓冲液(PBS)的浸泡时间为30min。优选地，所述步骤(2)中所述室温静止等待的时间为4小时。优选地，所述步骤(2)中所述磷酸缓冲液(PBS)冲洗为两次。有益效果：本专利技术以微球腔阵列生物芯片技术为基础，将其整合于单细胞定位与筛选应用，有效的降低了单细胞定位与筛选的操作难度，规范了操作流程，并有利于后期检测分析的开展。该芯片化的检测方案简洁，高效，成本低廉。对于细菌细胞的定位与筛选具有广泛的应用价值。下面通过附图和具体实施方式对本专利技术做进一步说明，但并不意味着对本专利技术保护范围的限制。附图说明图1-1是本专利技术微纳米球腔的俯视结构示意图。图1-2是本专利技术微纳米球腔的横向截面结构示意图。图2是本专利技术微纳米球腔阵列制备流程。图3-1是本专利技术细菌细胞放置过程示意图。图3-2是本专利技术细菌细胞放置后的横向截面结构示意图。图3-3是本专利技术微球放置后的横向截面结构示意图。图4是本专利技术结合光纤扫描实现细菌细胞的定位与筛选示意图。具体实施方式如图1-1所示，是本专利技术微纳米球腔的俯视结构示意图；如图1-2所示，是本专利技术微纳米球腔的横向截面结构示意图；如图2所示，是本专利技术微纳米球腔阵列制备流程；如图3-1所示，是本专利技术细菌细胞放置过程示意图；如图3-2所示，是本专利技术细菌细胞放置后的横向截面结构示意图；如图3-3所示，是本专利技术微球放置后的横向截面结构示意图；如图4所示，是本专利技术结合光纤扫描实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于微纳米球腔阵列的单细胞定位与筛选的生物芯片，其特征在于：由氧化铟锡基底与微球腔碗状结构的上层单元组成，氧化铟锡基底透明且具有良好的导电性，微球腔碗状结构的上层单元是多个微纳米球腔形成的独立的隔离单元阵列，微纳米球腔的材料为三氧化二铝，微纳米球腔的底部基底裸露。

【技术特征摘要】
1.一种基于微纳米球腔阵列的单细胞定位与筛选的生物芯片，其特征在于：由氧化铟锡基底与微球腔碗状结构的上层单元组成，氧化铟锡基底透明且具有良好的导电性，微球腔碗状结构的上层单元是多个微纳米球腔形成的独立的隔离单元阵列，微纳米球腔的材料为三氧化二铝，微纳米球腔的底部基底裸露。2.根据权利要求1所述的基于微纳米球腔阵列的单细胞定位与筛选的生物芯片，其特征在于：所述微纳米球腔阵列具有可以通过光纤光谱仪扫描阵列排序，形成编码阵列，用于单细胞细菌的定位与筛选。3.根据权利要求1所述的基于微纳米球腔阵列的单细胞定位与筛选的生物芯片，其特征在于：所述的单细胞为细菌细胞。4.根据权利要求1所述的基于微纳米球腔阵列的单细胞定位与筛选的生物芯片，其特征在于：所述的氧化铟锡基底的高度0.8cm，尺寸1.5cm*2cm。5.根据权利要求1所述的基于微纳米球腔阵列的单细胞定位与筛选的生物芯片，其特征在于：所述的氧化铟锡的导电率8-12/sq。6.根据权利要求1所述的基于微纳米球腔阵列的单细胞定位与筛选的生物芯片，其特征在于：所述微纳料球腔的内径1.8μm-2μm，高度1μm-1.2μm之间，所述的微纳料球腔阵列长1.8cm，宽1.5cm。7.权利要求1-6中任一项所述基于微纳米球腔阵列的单细胞定位与筛选的生物芯片的制备方法，其步骤如下：(1)氧化铟锡玻璃，用王水浸泡，去离子水清洗干净；(2)将清洗干净的氧化铟锡玻璃，浸泡在十二烷基硫酸钠中，静止吸附，增加氧化铟锡玻璃的亲水性，氧化铟锡玻璃用氮气吹干待用；(3)选取聚苯乙烯微球，配置成无水乙醇和去离子水的10wt％悬浊液，震荡混合均匀；(4)利用自组装...

【专利技术属性】
技术研发人员：李舟，刘儒平，李秀燕，封红青，李喆，李路海，朱文佳，
申请(专利权)人：北京纳米能源与系统研究所，北京印刷学院，
类型：发明
国别省市：北京,11