本发明专利技术公开了一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法、检测试剂盒及应用，所述的乳酸菌饮料中的嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法包括的步骤有：一、以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；二、检测扩增产物的荧光信号；三、计算待测样品中嗜酸乳杆菌成分的含量；其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对和嗜酸乳杆菌成分的特异性探针。本发明专利技术根据嗜酸乳杆菌NCFM的SPIDR保守区域设计引物和探针，并构建检测试剂盒，应用于嗜酸乳杆菌成分的定量检测，其检测方法准确、快速，具有较好的工业应用价值。
【技术实现步骤摘要】
乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法、检测试剂盒及应用
本专利技术属于生物工程领域，具体地说，是关于一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法、检测试剂盒及应用。
技术介绍
嗜酸乳杆菌是重要的益生菌，被大量应用在食品中。研究表明嗜酸乳杆菌能在乳制品中产生乳酸，并能通过氨基酸代谢增加风味。其主要作用有降低pH，产生抗菌素，如嗜酸菌素和乳酸杀菌素等，在一定程度上抑制肠道中有害微生物的有害作用。Kumar等人发现嗜酸乳杆菌对大肠杆菌、腹泻致病菌等均有抑制作用(A.Kumar,W.A.Alrefai,A.Borthakur,P.K.Dudeja,LactobacillusacidophiluscounteractsenteropathogenicE.coli-inducedinhibitionofbutyrateuptakeinintestinalepithelialcells,AmericanJournalofPhysiologyGastrointestinal&LiverPhysiology,309(2015)G602)；大量的嗜酸乳杆菌还可阻碍胆固醇的合成，降低血浆中胆固醇含量；另外，对于乳糖不耐症也有一定的疗效。嗜酸乳杆菌对肠道菌群的平衡和对微生态的调节也证明其具有健康促进的作用(Y.Huang,Y.Zheng,TheprobioticLactobacillusacidophilusreducescholesterolabsorptionthroughthedown-regulationofNiemann-PickC1-like1inCaco-2cells,BritishJournalofNutrition,103(2010)473)。在我国，饮料中添加益生菌特别是嗜酸乳杆菌成为新的发展趋势。关于益生菌的使用我国发布了一系列的法律法规，2010年，在《卫生部公安厅关于印发<可用于食品的菌种名单>的通知》(卫办监督发[2010]65号)，规定了食品中允许使用的菌种。2013年卫生部发布了关于食品中使用菌种标签标识有关问题的复函(卫办监督函[2013]367号)中明确指出，预包装食品中使用了上述菌种的，应当按照《预包装食品标签通则》(GB7718-2011)的要求标注其菌种名称，企业可同时在预包装食品上标注相应的菌株名、菌株号和活菌量。2016年制定了关于乳酸菌检测方法的标准《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》并在《GB7101-2015食品安全国家标准饮料》规定乳酸菌饮料产品标签应标明活菌或非活菌，标识活菌的其活菌数至少要达到1×106CFU/mL。但是，该标准的检测方法基于培养法，操作复杂、结果判读时间长，耗时耗力，而且结果受操作者经验影响较大，很难满足市场快速检测和精确定量的要求。目前，利用分子生物法进行检测的手段已在食品微生物检测中得到应用。Guo等人研究了发酵食品中嗜酸乳杆菌的检测技术(Z.Guo,H.Fang,Z.Xia,X.Zhu,Z.Sun,H.Yu,J.Xia,DetectionofLactobacillusacidophilusinFermentedMaterialbyReal-timeFluorescentQuantitativePCR,AnimalHusbandry&FeedScience,(2016)54-57)；Liu利用荧光定量PCR方法对发酵乳中的双歧杆菌进行检测，并与平板计数法进行比较，结果显示PCR法与平板法技术结果相符(劉佳欣,Liu,JiaXin,IdentificationandquantificationofBifidobacteriuminsimulatedfermentedmilkbyreal-timequantitativePCR,(2011))。这些均证明实时荧光定量PCR可以在乳酸菌饮料的检测中应用，且具有快速、通量高、重复性高等优点。但是，目前国内外对嗜酸乳杆菌的定量检测研究报道较少。为防止市场上出现滥竽充数的情况，有必要建立一种快速、简便、高效、准确的乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌的定量检测方法。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法，以解决现有的用于检测乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的方法操作复杂、费时费力的问题；本专利技术的第二个目的是提供一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的检测试剂盒，以使乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的检测快速、准确；本专利技术的第三个目的是提供一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的检测试剂盒的应用。本专利技术的第四个目的是提供一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对和特异性探针。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：作为本专利技术的第一个方面，一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法，该方法包括以下步骤：步骤一：以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；步骤二：检测扩增产物的荧光信号；步骤三：计算待测样品中嗜酸乳杆菌的含量；其中，用于荧光定量PCR扩增的反应体系中含有扩增嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对和嗜酸乳杆菌成分的特异性探针，所述扩增嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对的序列如SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示；所述嗜酸乳杆菌成分的特异性探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。根据本专利技术，步骤一的PCR扩增的反应体系和反应条件如下：实时荧光定量PCR的反应体系为20μL，包含TaKaRaProberTaqmix10μL，上、下游引物各1μL5μmol/L，探针0.5μL5μmol/L，2.0μLDNA模板，去离子水补足至20μL；进行PCR扩增的反应条件：95℃、30s；95℃、5s，60℃、35s，40个循环。作为本专利技术的第二个方面，一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：(a)扩增嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对，所述扩增嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对的序列如SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示；(b)嗜酸乳杆菌成分的特异性探针，所述嗜酸乳杆菌成分的特异性探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。根据本专利技术，所述的检测试剂盒还包括：嗜酸乳杆菌标准参照物。作为本专利技术的第三个方面，一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的检测试剂盒的应用，所述检测试剂盒在定量检测乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分中的应用。作为本专利技术的第四个方面，一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对和特异性探针，所述特异性引物对的序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示，所述特异性探针的序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术的有益效果是：1、可快速、简便地检测乳酸菌饮料中是否存在嗜酸乳杆菌成分以及定量检测乳酸菌饮料中的嗜酸乳杆菌成分的含量；2、本专利技术的乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法的特异性好，灵敏度高，重复性好，抗干扰性强；3、本专利技术的乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法的适用范围广，特别适用于乳酸菌饮料中的嗜酸乳杆菌成分的检测，因此可以推广应用，对保障产品的质量，保护消费者知情权和选择权，维护正常的经济秩序等提供了技术支持，为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；步骤二：检测扩增产物的荧光信号；步骤三：计算待测样品中嗜酸乳杆菌的含量；其中，用于荧光定量PCR扩增的反应体系中含有扩增嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对和嗜酸乳杆菌成分的特异性探针，所述扩增嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；所述嗜酸乳杆菌成分的特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
【技术特征摘要】
1.一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；步骤二：检测扩增产物的荧光信号；步骤三：计算待测样品中嗜酸乳杆菌的含量；其中，用于荧光定量PCR扩增的反应体系中含有扩增嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对和嗜酸乳杆菌成分的特异性探针，所述扩增嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对的序列如SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示；所述嗜酸乳杆菌成分的特异性探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。2.如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤一的PCR扩增的反应体系和反应条件如下：实时荧光定量PCR的反应体系为20μL，包含TaKaRaProberTaqmix10μL，上、下游引物各1μL5μmol/L，探针0.5μL5μmol/L，2.0μLDNA模板，去离子水补足至20μL；进行...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘洋，张娜娜，俞漪，窦同海，赵渝，曲勤凤，张清平，翁史昱，徐琼，
申请(专利权)人：上海市质量监督检验技术研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。