一种用于乳腺癌诊断的标记物及其筛选方法技术

本发明专利技术提供了一种用于乳腺癌诊断的标记物及其筛选方法，属于生物技术领域，通过筛选乳腺癌患者组织标本，得到一种用于乳腺癌诊断的tRF&tiRNA标记物：5′‑tiRNAVal，本发明专利技术提供的5′‑tiRNAVal是一个低表达于乳腺癌的tiRNA，与乳腺癌的增殖、转移密切相关，具有早期诊断和预后判断的潜在价值。

【技术实现步骤摘要】
一种用于乳腺癌诊断的标记物及其筛选方法
本专利技术属于生物
，特别是涉及一种用于乳腺癌诊断的标记物及其筛选方法。
技术介绍
乳腺癌在我国女性恶性肿瘤中发病率位居第一位，死亡率位居第六位，严重危害人们的健康和生活。尽管在药物敏感性和外科技术上已有巨大的突破，但复发和转移的频繁发生，仍是晚期乳腺癌患者死亡的主要原因。目前临床诊断乳腺癌的方法主要依赖于体格检查和影像学检查，但这些方法对于早期乳腺癌的发现敏感性很低，常用来诊断乳腺癌的血清标志物对早期诊断的敏感性和特异性均不理想。因此，深入理解乳腺癌的发生和发展机制，积极筛选鉴定有效的诊断和预后标志物，对提高乳腺癌检出率和治愈率具有重要意义。随着恶性肿瘤的研究从功能基因层面(编码蛋白质)逐渐拓展到非编码RNA领域，tRF&tiRNA(tRNAfragments&tRNAhalves)引起广泛关注，tRF&tiRNA相关研究是一个全新的领域，在肿瘤方面的研究刚刚起步，具有类似于miRNA的调控功能，并能参与调控基因转录和翻译，细胞增殖以及细胞应激反应。有研究提示tiRNAs在鼠血清中稳定性表达，具有转录前抑制功能，可能是一类新型信号分子。因此，从tRF&tiRNA角度挖掘乳腺癌新型分子靶标并探讨分子机制十分必要。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题时提供一种tRF&tiRNA，该tRF&tiRNA的异常表达与乳腺癌的发生相关，能够作为乳腺癌早期诊断或预后判断的标记物。一种用于乳腺癌诊断的标记物，所述的标记物为5′-tiRNAVal。一种用于乳腺癌诊断的标记物的筛选方法，方法如下：A.对若干乳腺癌患者组织标本进行测序，芯片检测的原始数据进行均一化处理，初筛出差异倍数2倍以上的tRFs&tiRNAs；筛选出差异倍数＞2，并且P＜0.05的tRFs&tiRNAs；完全配对、不存在错配，删除同一个tRFs&tiRNAs的重复注释项目，剔除具有编码蛋白潜能、表达丰度过低的tRFs&tiRNAs，再进行聚类分析；进一步缩小研究范围，筛选差异倍数＞2.5、P＜0.05的tRFs&tiRNAs、并结合基因本体功能富集分析和京都基因与基因组百科全书通路分析以及与乳腺癌相关文献检索，最终选出若干个tRFs&tiRNAs；B.将筛选出的tRFs&tiRNAs进行扩大组织样本RT-PCR检测，进一步筛选出表达差异倍数≥2、P＝0.000的tRFs&tiRNAs；C.将进一步筛选出的tRFs&tiRNAs进行血清RT-PCR检测，得到表达差异倍数最大的tRF&tiRNA，即为目标tRF&tiRNA。作为优选，所述的测序的工具为安捷伦生物分析仪2100、IlluminaNextSeq500高通量台式二代测序系统及高通量基因表达数据库。作为优选，所述的乳腺癌患者组织标本的例数为6。作为优选，步骤A中，最终选出的tRFs&tiRNAs的个数为6。作为优选，所述的RT-PCR检测工具为tRFs&tiRNAPCR芯片。本专利技术采用tRFs&tiRNAPCR芯片进一步筛选出乳腺癌组织和血清中具有显著表达差异的tiRNA：5′-tiRNAVal，5′-tiRNAVal是一个低表达于乳腺癌的tiRNA，与乳腺癌的增殖、转移密切相关，具有早期诊断和预后判断的潜在价值。附图说明图1为本专利技术的5′-tiRNAVal的结构图；图2为本专利技术高通量测序乳腺癌患者组织中差异表达的tRFs&tiRNAs图；图3为本专利技术聚类分析乳腺癌患者组织中差异表达的tRFs&tiRNAs图；图4为本专利技术乳腺癌组织(癌和癌旁)RT-PCR筛选出的AS-tDR-001430的表达水平图；图5为本专利技术乳腺癌组织(癌和癌旁)RT-PCR筛选出的AS-tDR-001130的表达水平图；图6为本专利技术乳腺癌组织(癌和癌旁)RT-PCR筛选出的AS-tDR-000779的表达水平图；图7为本专利技术乳腺癌组织(癌和癌旁)RT-PCR筛选出的AS-tDR-001430、AS-tDR-001130和AS-tDR-000779的表达水平对比图；图8为本专利技术6条待验证tRFs&tiRNAs实时定量PCR引物序列图；图9为本专利技术RT-PCR检测乳腺癌和癌旁组织中5′-tiRNAVal水平图；图10为本专利技术RT-PCR检测乳腺癌血清中5′-tiRNAVal水平与正常水平对比图；图11为本专利技术RT-PCR检测乳腺癌血清中5′-tiRNAVal水平在不同时期的对比图；图12为本专利技术AS-tDR-001430所在的染色体位置示意图。具体实施方式以下实施例仅用于说明本专利技术，但不限制本专利技术的保护范围。实施例一1.目标tRF&tiRNA筛选1)从生物样本库中获取6例乳腺癌患者组织标本(癌及癌旁)，应用安捷伦生物分析仪2100(AgilentBioAnalyzer2100)文库准备、IlluminaNextSeq500高通量台式二代测序系统测序及高通量基因表达数据库(GeneExpressionOmnibus)大数据分析筛选tRFs&tiRNAs，结果显示：组织中差异表达2倍以上的tRFs&tiRNAs共1135个(上调496个、下调639个，如图2所示)；2)根据差异倍数FC(Foldchange)＞2，P＜0.05(FC越大，说明两个样本之间的差异越大，P值(Pvalue)当原假设为真时所得到的样本观察结果或更极端结果出现的概率，是用来判定假设检验结果的一个参数,是最常用的统计指标之一，P越小，说明差异基因的可靠性越高)，完全配对，不存在错配，删除同一个tRF&tiRNA的重复注释，剔除具有编码蛋白潜能、表达丰度过低的tRFs&tiRNAs，通过聚类分析，得出符合条件指标的tRFs&tiRNAs：上调17个、下调14个(如图3所示)；3)以FC＞2.5、P＜0.05、并结合基因本体功能富集分析(GeneOntology功能富集分析)和京都基因与基因组百科全书通路分析(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes通路分析)以及与乳腺癌相关文献检索，最终选出6个差异表达的tRFs&tiRNAs：上调4个(AS-tDR-001356，FC＝3.66，P＝0.000；AS-tDR-000882，FC＝2.90，P＝0.008；AS-tDR-000014，FC＝4.89，P＝0.000；AS-tDR-000779，FC＝6.58，P＝0.023)，下调2个(AS-tDR-001430，FC＝-2.65，P＝0.019；AS-tDR-001130，FC＝-4.90，P＝0.028)。2.测序筛选的6条tRFs&tiRNAs的组织RT-PCR检测(如图8所示)采用RT-PCR检测16对组织(乳腺癌癌及癌旁)中的上述6个tRFs&tiRNAs的表达水平(引物序列见表2)，结果发现：高表达组中AS-tDR-000779(16/16例)上调2倍，P＝0.000(如图6所示)，其他3个tRFs&tiR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于乳腺癌诊断的标记物，其特征在于：所述的标记物为5′‑tiRNAVal。

【技术特征摘要】
1.一种用于乳腺癌诊断的标记物，其特征在于：所述的标记物为5′-tiRNAVal。2.一种用于乳腺癌诊断的标记物的筛选方法，其特征在于：方法如下：A.对若干乳腺癌患者组织标本进行测序，芯片检测的原始数据进行均一化处理，初筛出差异倍数2倍以上的tRFs&tiRNAs；筛选出差异倍数＞2，并且P＜0.05的tRFs&tiRNAs；完全配对、不存在错配，删除同一个tRFs&tiRNAs的重复注释项目，剔除具有编码蛋白潜能、表达丰度过低的tRFs&tiRNAs，再进行聚类分析；进一步缩小研究范围，筛选差异倍数＞2.5、P＜0.05的tRFs&tiRNAs、并结合基因本体功能富集分析和京都基因与基因组百科全书通路分析以及与乳腺癌相关文献检索，最终选出若干个tRFs&tiRNAs；B.将筛选出的tRFs&tiRNAs进行扩大组织样本RT-PCR检测，进一步筛选出...

【专利技术属性】
技术研发人员：严枫，
申请(专利权)人：江苏省肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32