稻瘟病菌孢子实时定量环介导等温扩增检测法及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于稻瘟病菌的q‑LAMP快速检测方法的LAMP特异性引物组合物以及包含该LAMP特异性引物组合物的用于定量检测稻瘟病菌的环介导等温扩增试剂盒；本发明专利技术还同时公开了一种用于定量检测稻瘟病菌的环介导等温扩增方法，包括以下步骤：一、进行LAMP反应；二、判断：以荧光信号作为结果判定依据，当荧光值大于50时，判定结果为阳性，即待测样品中含稻瘟病菌DNA；反之，当荧光信号小于50时，判定结果为阴性，即待测样品中无稻瘟病菌DNA。本发明专利技术具有特异性强、鉴定快速的技术优势。

【技术实现步骤摘要】
稻瘟病菌孢子实时定量环介导等温扩增检测法及试剂盒
本专利技术涉及一种稻瘟病的实时定量环介导等温扩增(q-LAMP)检测方法及试剂盒，属于植物病害检测、鉴定及防治的早期预警

技术介绍
稻瘟病(riceblast)是由稻瘟病菌[Magnaporthegrisea(Hebert)Barr.]引起的真菌性病害。稻瘟病是目前对水稻生产危害最大的流行性真菌病害，给水稻产量带来巨大的损失。稻瘟病在水稻的不同组织部位和不同生育期均能发生，可侵染水稻叶片、茎节、穗颈和谷粒，其中穗颈瘟对稻谷产量的影响最大。在稻瘟病流行年份，田间损失轻则减产10～20％，重则减产40～50％，甚至颗粒无收。近些年，我国东北、西南及长江中下游等重要水稻种植地区连续发生，全国发病总面积高达330～570万hm2，稻米减产数亿吨，在稻瘟病流行的年份甚至失去收获价值，己给我国水稻的安全生产及提高粮食作物产量带来了巨大的压力。稻瘟病菌的初侵染主要主要来自病谷和病稻草。在自然界，稻瘟病菌主要依靠无性态的分生孢子进行侵染。翌年当气温上升到20℃左右并且遇到降雨时，就能不断产生分生孢子。夜间12时至次日凌晨6时产生的孢子最多。当稻瘟病菌接触水稻后，在适宜条件下发生以下的侵染过程：(1)病菌的分生孢子接触水稻叶表面后，其尖端释放的粘胶以及形成的芽管使孢子紧密地粘着在水稻叶表面；(2)芽管分化成特殊的侵染机构附着胞；(3)附着胞产生侵染丁穿透附着胞小孔和植物表面；(4)病菌分化成次生菌丝在寄主细胞中生长，并侵染邻近表皮细胞和深入叶肉细胞；(5)5～7d后出现症状，分生孢子梗产生大量的新的分生孢子，并且从病斑中释放出来；(6)新形成的分生孢子再次侵染寄主。后期以菌丝体和分生孢子在病谷和病稻草上越冬，完成侵染循环。实时监测稻瘟菌的菌源量并结合栽培品种和天气等发病条件，把握好病害防治适期，可以有效控制该病害的发生与流行。常规植物病害的流行监测多为根据发病症状进行发病率、病情级数调查或镜检捕捉的气传孢子样品以确定病原菌群体数量的变化，但是这些传统方法受个人主观因素影响较大，需要专业技术人员进行操作，且费时费力。实时q-PCR技术可以实现对病原菌的定量检测，但是该检测方法对受检样品的要求高，难以对粗提的复杂样品DNA进行准确定量。因此，开发出一种灵敏度高、操作简便、成本低廉且能对空气中和植物组织中病原菌进行定量的检测体系显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一套用于实时定量检测稻瘟病菌的环介导等温扩增引物组合物和以及含有该引物的试剂盒。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种检测稻瘟病菌的q-LAMP引物组合物，由上下游外引物，上下游内引物四条引物组成，引物序列如下：上游外引物(F3)：5’—GGAACTTGTAGCACTCGGC—3’；下游外引物(B3)：5’—TGGTGGCGGTTATGAGAGG—3’；上游内引物(FIP)：5’—TGGGGTTGTTGCTGCTGCTGCAAGAGAAACCCACCGCATC—3’；下游内引物(BIP)：5’—CACAACCAGCCCAAAAGCCCGGGGTTTGGTGAGGAACTC—3’。本专利技术还提供了用于定量检测稻瘟病菌的环介导等温扩增试剂盒：包含上述LAMP特异性引物组合物。具体为：20μM的正内向引物FIP，20μM的反向内引物BIP、10μM正向外引物F3、10μM反向外引物B3。作为本专利技术的用于定量检测稻瘟病菌的环介导等温扩增试剂盒的改进，该试剂盒还包含10×ThermoPolBuffer、1mmol/LdNTPs、4mmol/LMgCl2、0.6mmol/L甜菜碱、10×SYBRGreenI、8U/μLBstDNA聚合酶、ddH2O。即，本专利技术所述的q-LAMP试剂盒，包含环介导等温扩增引物混合液和环介导等温扩增反应预混液构成的检测溶液，引物组合混合液浓度为：1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3；环介导等温扩增反应预混液：10×ThermoPolBuffer、1mMdNTPs、4mMMgCl2、0.6M甜菜碱、10×SYBRGreenI、8U/μLBstDNA聚合酶、ddH2O。本专利技术还提供上述引物组合或试剂盒在定量检测稻瘟病菌的应用，具体而言，本专利技术提供一种用于定量检测稻瘟病菌的环介导等温扩增方法，依次进行以下步骤：一、进行LAMP反应：LAMP反应体系为20μL(检测溶液共19μL，加入待测DNA模板1μL，构成20μL检测反应体系)；其中，8U/μLBstDNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPolBuffer2.5μL、20μMFIP引物2.0μL、20μMBIP引物2.0μL、10μMF3引物0.5μL、10μMB3引物0.5μL、25mMMgCl24.0μL、10mMdNTPs2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、10×SYBRGreenI1μL、待测菌DNA模板(例如为稻瘟病菌DNA模板)1μL，双蒸水补足至20μL；扩增条件为63.4℃，1min，60个循环；80℃反应10min，终止反应；二、判断：以荧光信号(荧光值)作为结果判定依据，当荧光值大于50时，判定结果为阳性，即待测样品中含稻瘟病菌DNA；反之，当荧光信号小于50时，判定结果为阴性，即待测样品中无稻瘟病菌DNA。作为本专利技术的环介导等温扩增方法的改进：定量线性回归方程为y＝-0.3066x+15.33，其中为y为稻瘟病菌孢子数对数值，x为扩增反应时间(分钟)；孢子数量(个)计算公式为100.60y。即，本专利技术的扩增结果的分析和判定方法包括：在扩增前加入SYBRGreenI作为反应指示剂，以荧光信号做为结果判定依据，反应结束后仪器自动根据标准曲线显示定量结果。根据LAMP扩增反应时间与梯度稀释稻瘟病菌孢子数量制成标准曲线，再根据待测样品的反应时间，可准确算出该样品的孢子起始浓度。本专利技术的方法能定量检测稻瘟病菌，克服以往实时荧光定量PCR检测方法的不足，具有高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定等优点，不开盖就能灵敏地检测反应产物，该方法不易受污染物的影响且能现场检测环境中的样品，分析判断反应产物的方法极为简单，适宜于广泛地推广应用。本专利技术的方案包括：(1)根据稻瘟病菌黑色素合成相关的ALB1基因序列(NCBI登录号为：XM_003719764)的DNA序列设计特异性引物；(2)q-LAMP扩增及扩增反应的检测；(3)q-LAMP引物的特异性检测；(4)稻瘟病菌孢子的q-LAMP检测；(5)稻瘟病显症前的q-LAMP检测。本专利技术的方案具体如下：1、引物的设计：首先专利技术人从NCBI上下载了稻瘟病菌ALB1基因序列，使用primerexplorerV5(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计多组引物，然后根据引物所在序列区域的保守性、引物的发夹结构、二聚体GC含量以及Tm值等综合因素进行引物的设定和选择。最后为稻瘟病菌的检测选择了4条引物，包括2条外引物(F3和B3)和2条内引物(FIP和BIP)。所述引物信息见表1。表1、引物序列信息：引物名称序列5'-3'Mog-2F3GGA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于稻瘟病菌的q‑LAMP快速检测方法的LAMP特异性引物组合物，其特征在于：所述LAMP特异性引物组合物由上下游外引物、上下游内引物这四条引物组成；上游外引物(F3)：5’—GGAACTTGTAGCACTCGGC—3’；下游外引物(B3)：5’—TGGTGGCGGTTATGAGAGG—3’；上游内引物(FIP)：5’—TGGGGTTGTTGCTGCTGCTGCAAGAGAAACCCACCGCATC—3’；下游内引物(BIP)：5’—CACAACCAGCCCAAAAGCCCGGGGTTTGGTGAGGAACTC—3’。

【技术特征摘要】
1.用于稻瘟病菌的q-LAMP快速检测方法的LAMP特异性引物组合物，其特征在于：所述LAMP特异性引物组合物由上下游外引物、上下游内引物这四条引物组成；上游外引物(F3)：5’—GGAACTTGTAGCACTCGGC—3’；下游外引物(B3)：5’—TGGTGGCGGTTATGAGAGG—3’；上游内引物(FIP)：5’—TGGGGTTGTTGCTGCTGCTGCAAGAGAAACCCACCGCATC—3’；下游内引物(BIP)：5’—CACAACCAGCCCAAAAGCCCGGGGTTTGGTGAGGAACTC—3’。2.用于定量检测稻瘟病菌的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：包含如权利要求1所述的LAMP特异性引物组合物。3.根据权利要求2所述的用于定量检测稻瘟病菌的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含10×ThermoPolBuffer、1mmol/LdNTPs、4mmol/LMgCl2、0.6mmol/L甜菜碱、10×SYBRGreenI、8U/μLBstDNA聚合酶、ddH2O。4.用于定量检...

【专利技术属性】
技术研发人员：张传清，张书亚，李玲，吴鉴艳，张宇，朱国念，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33