本发明专利技术公开了基于CRISPR‑链取代的等温扩增及检测技术。基于CRISPR‑链取代的等温扩增试剂盒，包括链取代等温扩增试剂，试剂盒还包括了野生型Cas9和/或核酸酶缺陷的Cas9切口酶、特异性识别目标DNA序列上下游的sgRNA对，链取代等温扩增反应的扩增引物对，该引物对与Cas9‑sgRNA复合体对与目的基因结合后暴露出的单链区域互补。该技术操作简单，抗干扰能力强，检测结果准确可靠。
【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR-链取代的等温扩增及检测技术
本专利技术涉及一种核酸扩增技术及基于该技术的检测技术，特别涉及基于CRISPR-链取代的等温扩增及检测技术。
技术介绍
核酸分子基于其生物特性被视为重要的生物标志物。核酸分子的检测在医学诊疗、食品安全、公共卫生和社会安全等方面有着广泛的应用。通常，在核酸检测过程中，待检样品中的靶核酸分子浓度极低，而非靶核酸分子浓度则较高。因此，对待检测样品中的靶核酸分子特异性扩增是提高核酸检测反应的灵敏度和准确度的常用方法。目前，通过PCR扩增技术特异性地扩增待检测样品中的靶核酸分子(DNA)片段是核酸检测中使用的最主要的技术，也是目前最有效、最直接的方法。然而，PCR技术目前仍具有诸多难以克服的限制，例如：1)对模板DNA纯度要求高；2)对反应条件敏感，而实际待检测样品中往往存在对PCR反应有抑制作用的成分；3)扩增反应需经历多重变温反应，反应时间较长；4)检测反应所需设备及结果分析设备成本较高，只能在实验室完成；以及5)检测所需试剂成本高，且使用操作需经过专业培训，相关检测需耗费大量人力物力成本。同时，在医学诊疗、食品安全相关的实际检测中，需要开展实地检测，并尽可能在短的时间内获得靶核酸分子的检测结果。因此，基于PCR技术的核酸检测手段无法满足实际应用的需求，新的低成本，高效快速的核酸检测手段将因此具有广泛的应用潜力。针对上述问题，研究人员开发出了一系列核酸的等温扩增技术(IsothermalAmplification)以解决PCR扩增技术中面临的诸多问题。针对于DNA的检测，通常利用具有链取代功能的聚合酶(如KlenowFragment，Bst，等)，在有切口酶(如SDA技术)或无切口酶(如LAMP、RCA、HDA和RPA等技术)参与下，在1-2小时内将靶DNA的扩增至可被检测的水平(IsothermalinvitroamplificationofDNAbyarestrictionenzyme/DNApolymerasesystem,WalkerGT等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1992,89(1):392–396；Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA,NotomiT等,NucleicAcidsRes.,2000,28(12):e63；RollingreplicationofshortDNAcircles,FireA等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1995,92(10):4641–4645；Helicase-dependentisothermalDNAamplification,VincentM等,EMBORep.,2004,5(8):795–800；DNAdetectionusingrecombinationproteins,PiepenburgO等,PLoSBiol.,2006,4(7):e204)。对于RNA样品，则通常先利用逆转录酶将RNA逆转录为DNA，再以DNA为模板进行等温扩增(如NASBA和SMART等技术)(Isothermal,invitroamplificationofnucleicacidsbyamultienzymereactionmodeledafterretroviralreplication,GuatelliJC等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1990,87(5):1874–1878；SpecificdetectionofDNAandRNAtargetsusinganovelisothermalnucleicacidamplificationassaybasedontheformationofathree-wayjunctionstructure,WharamD等,NucleicAcidsRes.,2001,29(11):e54)。等温扩增技术在反应过程中不依赖于温度变化或热循环过程完成核酸扩增，因此可显著缩短扩增时间，并降低扩增反应的仪器成本。同时，由于大多数等温扩增体系对常见的PCR反应抑制剂不敏感，其样品的预处理过程可进一步简化，进一步降低了相应的操作难度和复杂程度。这些特征使得等温扩增技术被广泛应用在诸如传染病检测、食品致病菌检测、转基因作物检测等方面，并被逐渐发展成为成熟的商品化试剂盒。然而，目前的大多数商业化的等温扩增技术仍有一些尚未克服的缺陷，例如，引物设计较为复杂(如LAMP技术)，以及无法区别核酸序列中单核苷酸的差异等。因此，新的快速、高效、高灵敏度的核酸检测手段具有重要的应用价值。CRISPR(ClusteredRegularlyInterspersedShortPalindromicRepeats，规律成簇间隔短回文重复)是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。Cas9蛋白是CRISPR系统的效应蛋白，其作为一种RNA导向的双链DNA结合蛋白，是目前已知的第一个统一因子，能够特异性地精确定位及编辑基因组中的几乎任何双链DNA序列。CRISPR-Cas9技术的应用截至目前仍主要集中在基因编辑和基因治疗两个方面。基于该技术所具有的低成本、体系简单、高效率、高特异性及高灵敏度等特点，其在核酸检测领域技术应该具有同样广泛的应用前景。利用CRISPR技术对靶核酸分子进行检测近期已开始见于报道。CN105177110A公开了一种基于Cas9融合蛋白对目标核酸进行检测的体外方法，该方法即在靶核酸序列存在的情况下，通过与靶序列特异性结合，由一对Cas9融合蛋白共同产生可被检测的荧光信号。另有报道利用CRISPR效应蛋白Cas13a特异性检测RPA技术扩增后的核酸产物(NucleicaciddetectionwithCRISPR-Cas13a/C2c2,GootenbergJS等,Science,2017,356(6336):438-442)。然而，这些技术都是基于现有的等温扩增技术先对靶DNA分子进行扩增，再以CRISPR技术进行检测。以CRISPR技术为起始进行靶核酸特异性扩增的方法尚未见于报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供基于CRISPR-链取代的等温扩增试剂盒及方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种基于CRISPR-链取代的等温扩增试剂盒，包括链取代等温扩增试剂，试剂盒还包括了野生型Cas9和/或核酸酶缺陷的Cas9切口酶、特异性识别目标DNA序列上下游的sgRNA对，链取代等温扩增反应的扩增引物对，该引物对与Cas9-sgRNA复合体对与目的基因结合后暴露出的单链区域互补。作为上述等温扩增试剂盒的进一步改进，核酸酶缺陷的Cas9切口酶为HNH核酸酶缺陷的Cas9切口酶。作为上述等温扩增试剂盒的进一步改进，sgRNA对的识别位点分别为目的序列上游CCN序列3’端的10～30个核苷酸序列和下游NGG序列5’端的10～30个核苷酸序列。作为上述等温扩增试剂盒的进一步改进，sgRNA对识别位点的间距100～1000bp，优选100～250bp，识别位点5’端以CCN为起点，3’端靶序列以NGG为终点。作为上述等温扩增试剂盒的进一步改进，链取代等温扩增试剂的DNA引物具有如下特征：该引本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于CRISPR‑链取代的等温扩增试剂盒，包括链取代等温扩增试剂，其特征在于：试剂盒还包括了野生型Cas9和/或核酸酶缺陷的Cas9切口酶、特异性识别目标DNA序列上下游的sgRNA对，链取代等温扩增反应的扩增引物对，该引物对与Cas9‑sgRNA复合体对与目的基因结合后暴露出的单链区域互补。
【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR-链取代的等温扩增试剂盒，包括链取代等温扩增试剂，其特征在于：试剂盒还包括了野生型Cas9和/或核酸酶缺陷的Cas9切口酶、特异性识别目标DNA序列上下游的sgRNA对，链取代等温扩增反应的扩增引物对，该引物对与Cas9-sgRNA复合体对与目的基因结合后暴露出的单链区域互补。2.根据权利要求1所述的等温扩增试剂盒，其特征在于：核酸酶缺陷的Cas9切口酶为HNH核酸酶缺陷的Cas9切口酶。3.根据权利要求1所述的等温扩增试剂盒，其特征在于：sgRNA对的识别位点分别为目的序列上游CCN序列3’端的10～30个核苷酸序列和下游NGG序列5’端的10～30个核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的等温扩增试剂盒，其特征在于：链取代等温扩增试剂的DNA引物具有如下特征：该引物5’端包含了一个切口酶识别位点，且该位点的酶切位点在其互补链上；该引物的中段与Cas-sgRNA复合体所识别的靶DNA区域的NGG序列所在链的至少10个连续核苷酸互补配对。5.根据权利要求4所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：喻学锋，周文华，胡丽，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44
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