缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶(MiDGAT2C)基因序列及功能鉴定制造技术

本发明专利技术涉及缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶(MiDGAT2C)基因序列(如SEQ ID NO:7所示)及其应用。其特点表现在：MiDGAT2C不同于本课题组已克隆到的另外两个DGAT2基因。将该基因转化至酵母的TAG合成缺陷株H1246中表达，发现该基因的转入确实能使该酵母缺陷株H1246恢复合成TAG，证明了该基因编码蛋白具有合成TAG的功能。并发现MiDGAT2C对花生四烯酸‑CoA没有催化活性，但能将亚油酸‑、γ‑亚麻酸‑或α‑亚麻酸‑CoA的酰基转至DAG甘油骨架的sn‑3位以产生TAG，且能力相近。

【技术实现步骤摘要】
缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶(MiDGAT2C)基因序列及功能鉴定
本专利技术涉及基因工程
，具体地说，涉及缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶(MiDGAT2C)基因序列及功能鉴定。
技术介绍
随着石油、煤、天然气等有限自然资源的不断耗尽，人类对可再生能源的需求日益强烈。科学家们急需寻求一种占地资源少、产业性能强、对环境污染可控的新型可再生能源。生物柴油，特别是微藻生物柴油以其得天独厚的优势越来越被科学家们所青睐。生物柴油的主要原料为三酰甘油(TAG)，它以油滴的方式存在于真核生物的细胞中。本专利技术有关的微藻是缺刻缘绿藻(MyrmeciaincisaReisiglH4301)，它是一种淡水单细胞微藻，隶属绿藻门(Chlorophyta)。该藻能大量积累TAG，特别在缺氮培养条件下，是潜在的微藻生物柴油藻种。TAG的合成有三条途径，其中Kennedy途径是唯一一条依赖于酰基-辅酶A(CoA)的途径，也是TAG合成的主要途径，该途径通过各种酰基转移酶依次把酰基-CoA的酰基链转移到甘油骨架的sn-1、sn-2和sn-3位置。酰基-CoA:二酰基甘油酰基转移酶(DGAT，EC2.3.1.20)作用于TAG生物合成的最后一步。它以酰基-CoA为底物，催化并使sn-1，2-二酰基甘油(DAG)甘油骨架的sn-3位酰化，从而形成TAG。同时，它也是一种限速酶，它有可能被用来增加含油植物包含微藻的含油量。到目前为止，发现DGAT有三个家族，分别为DGAT1、DGAT2和DGAT3。专利号为ZL201210477507.7的中国专利公开了一种缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶(MiDGAT2A)，专利号为ZL201310668330.3的中国专利公开了一种缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶(MiDGAT2B)，专利号为ZL201510646709.3的中国专利公开了一种缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶1(MiDGAT1)。但是，本专利技术的缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶(MiDGAT2C)还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种DNA序列。本专利技术的第二个目的是，提供一种DNA序列的应用。本专利技术的第三个目的是，提供一种蛋白。本专利技术的第四个目的是，提供一种蛋白的应用。本专利技术的第五个目的是，提供一种重组表达载体。本专利技术的第六个目的是，提供一种重组表达载体的应用。本专利技术的第七个目的是，提供一种cDNA序列。为实现上述第一个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种分离的DNA序列，其特征在于，所述的DNA序列为：a)如SEQIDNO:7所示的核苷酸序列；或b)与a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：所述的DNA序列在生产三酰甘油中的应用。将亚油酸-、γ-亚麻酸-或α-亚麻酸-CoA的酰基转至DAG甘油骨架的sn-3位以产生三酰甘油。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是：上述DNA序列编码的蛋白。为实现上述第四个目的，本专利技术采取的技术方案是：所述的蛋白在生产三酰甘油中的应用。为实现上述第五个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种重组表达载体，所述的重组表达载体中含有上述的DNA序列。所述的重组表达载体是由上述的DNA序列与质粒或病毒所构建的重组表达载体。所述的质粒是pYES2质粒。为实现上述第六个目的，本专利技术采取的技术方案是：所述的重组表达载体在生产三酰甘油中的应用。为实现上述第七个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种分离的cDNA序列，其特征在于，所述的cDNA序列为：a)如SEQIDNO:4所示的核苷酸序列；或b)与a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。本专利技术优点在于：基于缺刻缘绿藻转录组测序数据，我们得到了一条长为533bp的片段(Contig8563)，它与Auxenochlorellaprotothecoides(GenBank登录号：XP_011397007.1)的DGAT基因有54％同源性且通过基因序列比对发现其不同于本课题组已经公开的基因序列(专利号分别为ZL201210477507.7、ZL201310668330.3及ZL201510646709.3)。基于该片段序列并利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆到该基因的全长cDNA序列，通过同源序列比对及聚类分析确定该基因为DAGT2家族，并且不同于本课题组已克隆到的另外两个DGAT2基因(专利号分别为ZL201210477507.7和ZL201310668330.3)，我们将此命名为MiDGAT2C。将该基因转化至酵母的TAG合成缺陷株H1246中表达，即进行基因功能互补实验，发现该基因的转入确实能使该酵母缺陷株H1246恢复合成TAG，证明了该基因编码蛋白具有合成TAG的功能。为了进一步了解MiDGAT2C与MiDGAT2A和MiDGAT2B在功能上是否存在差异，我们对它们进行了体外酶活性及底物偏好性分析，发现MiDGAT2C对花生四烯酸(ArA)-CoA没有催化活性，但能将亚油酸(LA)-、γ-亚麻酸(GLA)-或α-亚麻酸(ALA)-CoA的酰基转至DAG甘油骨架的sn-3位以产生TAG，且能力相近。附图说明附图1：基于DGAT基因所编码的氨基酸序列构建的系统进化树。节点处的数值为自举值，基因的登录号放在拉丁学名后面的括号中，箭号指明本研究的基因。附图2：缺刻缘绿藻MiDGAT2C基因结构示意图。灰线是非翻译区，黑线为内含子，黑框为外显子。附图3：酵母油脂的TLC图谱。从左道到右道依次为TAG标准品(英国Nu-Chek公司)，缺陷株H1246，携带pYES2的转基因株，转MiDGAT2C的细胞株。附图4：酵母细胞的Bodipy染色图片。从左到右依次为酵母出发株Scy62，酵母缺陷株H1246，携带pYES2的转基因株，转MiDGAT2C的细胞株。图中的标尺长度相当于5μm。附图5：MiDGAT的底物偏好性分析结果。横坐标为酰基供体的脂肪酸，纵坐标为产生的TAG量。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。实施例1、材料1)缺刻缘绿藻(MyrmeciaincisaReisiglH4301)购自捷克布拉格查理斯大学藻类培养中心(CAUP)。在温度为25℃、光照强度为115μmolphotons/(m2·s)、光/暗比为12h/12h的条件下培养，培养基为BG-11。2)pYES2载体购自Invitrogen公司。酵母缺陷株H1246和出发株Scy62购自瑞典农业科技大学Dr.Stymne实验室。将酵母接种于SC培养基，在30℃下以200转/分钟(rpm)转速振荡培养。3)胶回收试剂盒、大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司；pMD-19T质粒、反转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；SMARTTMRACEcDNA扩增试剂盒购自Clontech公司；LA-CoA、ALA-CoA、GLA-CoA、ArA-CoA和16:0-18:1组成的DAG均购自Avanti公司；细胞裂解液IX购自上海杰美；其他试剂均为国产或进口，分析纯。2、方法1)取100mg刚收集本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的DNA序列，其特征在于，所述的DNA序列为：a)如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；或b)与a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种分离的DNA序列，其特征在于，所述的DNA序列为：a)如SEQIDNO:7所示的核苷酸序列；或b)与a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的DNA序列在生产三酰甘油中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将亚油酸-、γ-亚麻酸-或α-亚麻酸-CoA的酰基转至DAG甘油骨架的sn-3位以产生三酰甘油。4.根据权利要求1所述的DNA序列编码的蛋白。5.根据权利要求4所述的蛋白在生产三酰甘油中的应用。6.一种重组表达载体，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：周志刚，刘伟，陈春秀，房逢立，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31