一种获得海藻糖合成酶突变体的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种获得海藻糖合成酶突变体的方法及其应用。具体是对来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)的海藻糖合成酶活性位点附近的氨基酸进行饱和突变，以含有葡萄糖的麦芽糖溶液为底物，快速筛选海藻糖得率高的突变体酶。用此方法获得的突变体酶包括第286位的组氨酸突变为谷氨酰胺H286Q，第286位的组氨酸突变为天冬酰胺H286N和第339位的谷氨酸突变为精氨酸E339R。突变体酶能够利用常规生物工程的方法制备，并用于海藻糖的生产。本发明专利技术利用快速检测方法筛选海藻糖合成酶突变体，获得的突变体酶能够大幅降低葡萄糖对海藻糖合成酶活性的抑制作用，提高海藻糖合成酶转化效率，有很高的利用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种获得海藻糖合成酶突变体的方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体是一种获得海藻糖合成酶突变体的方法及其应用，及用此方法获得的能提高海藻糖转化率的海藻糖合成酶突变体，并将得到的海藻糖合成酶用于制造海藻糖。
技术介绍
海藻糖是由两分子葡萄糖以α,α-1,1-糖苷键相连而成，在自然界中广泛存在的天然性二糖。它自身性质非常稳定，并对多种生物活性物质具有保护作用。近年来，研究发现海藻糖能广泛应用于各类食品的鲜味保持及质地改善。随着社会的进步和人们生活水平的提高，人们对食品的质量和口感日趋重视，这增加了人们对海藻糖的需求。因此，大规模的廉价高效生产海藻糖具有极大的经济价值，同时也将更能推广和普及海藻糖在食品领域的使用。研究已发现自然界中有多种酶系能够合成海藻糖。其中一种是在许多微生物中都能发现的海藻糖合成酶(TrehaloseSynthase)。此酶能够将麦芽糖直接转化成为海藻糖，比较适宜应用于工业化生产海藻糖。来源于脂肪杆菌弯曲高温单孢菌(Thermomonosporacurvata)的海藻糖合成酶(tcTreS)能够高效的将麦芽糖转化成为海藻糖。然而，tcTreS除了能够可逆催化麦芽糖分子内转糖基生成海藻糖外，还有微弱的水解麦芽糖生成葡萄糖的功能。过高的葡萄糖含量能够抑制海藻糖的生成。目前，尚无将来源于脂肪杆菌弯曲高温单孢菌(Thermomonosporacurvata)的海藻糖合成酶进行分子改造，降低葡萄糖的抑制作用，提高海藻糖转化效率的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种获得海藻糖合成酶突变体的方法及其应用，该方法是通过对来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonosporacurvata)的海藻糖合成酶活性位点附近的氨基酸进行饱和突变，筛选海藻糖得率高的突变体酶；利用常规生物工程的方法制备性能优异的突变体酶，并用于海藻糖的生产。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：获得一种来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonosporacurvata)的海藻糖合成酶的突变体，其特征在于，第286位的组氨酸替换为谷氨酰胺H286Q，或第286位的组氨酸替换为天冬酰胺H286N，或第339位的谷氨酸替换为精氨酸E339R；来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonosporacurvata)的海藻糖合成酶的序列如SEQIDNO.1所示。获得上述的海藻糖合成酶突变体的方法，是对来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonosporacurvata)的海藻糖合成酶活性位点附近的氨基酸进行饱和突变，以含有葡萄糖的麦芽糖溶液为底物，用DNS方法检测产物快速筛选海藻糖得率高的突变体酶；所述的海藻糖合成酶活性位点附近的氨基酸包括第280位的谷氨酸，第286位的组氨酸，第335位的甲硫氨酸和第339位的谷氨酸；将上述的海藻糖合成酶突变体基因转入宿主细胞，然后利用该宿主细胞进行常规发酵生产海藻糖合成酶；上述的宿主细胞为常规基因工程表达宿主细胞，包括大肠杆菌细胞和枯草芽孢杆菌细胞。以麦芽糖浆或淀粉浆为原料，通过常规酶法转化生产海藻糖的方法，用上述海藻糖合成酶的生产方法得到的海藻糖合成酶制造海藻糖。本专利技术首次将来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonosporacurvata)的海藻糖合成酶进行分子改造，获得性能优异的海藻糖合成酶突变体，利用常规的生物工程方法，发酵生产海藻糖合成酶突变体酶。生产的海藻糖合成酶能够以麦芽糖浆或淀粉浆为原料制造海藻糖。本专利技术的优点是：本专利技术获得的海藻糖合成酶突变体酶，能够利用含葡萄糖的麦芽糖浆或淀粉糖浆为原料，高效生产海藻糖。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步描述。但需要说明的是，实施例并不构成对本专利技术要求保护范围的限制。实施例1本实施例说明获得来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonosporacurvata)的海藻糖合成酶突变体的方法。1.构建重组表达质粒pSE380-tcTreS人工合成如下tcTreS基因的DNA片断：合成的片段和质粒pSE380用限制性内切酶NcoI和HindIII分别进行双酶切后,胶纯化所需片段，然后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5ɑ中，经筛选鉴定获得重组表达质粒pSE380-tcTreS。2.含突变体酶基因的表达质粒pSE380-tcTreS-H286Q和pSE380-tcTreS-H286N的获得以表达质粒pSE380-tcTreS(已甲基化)为模板，PTH-L和PTH-R为引物，通过一步反向PCR法，对该基因编码的第286位点的组氨酸进行饱和突变。引物PTH-L序列：5’-CGAGTGCCACATGGCCTTCNNNTTCCCGGTGATGCC-3’引物PTH-R序列：5’-GGCATCACCGGGAANNNGAAGGCCATGTGGCACTCG-3’(N:dNTPs)25μL的PCR反应体系和PCR扩增程序：以10～20ng表达质粒pSE380-tcTreS为模板，以引物Pul3和Pul4进行PCR，退火温度60.0℃30sec，延伸温度和时间72℃7.0min，PCR产物经过模板消化后，转化大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞。从转化子中挑选192个转化子分别接种至两个每孔含1mLLB液体培养基的96孔深孔培养板中。37℃，250rpm摇床培养14小时后，加入1mMIPTG，继续诱导培养8小时后，加入1μLTritonX-100破胞，然后按下述方法，以0.2MpH6.5磷酸缓冲液配置的30％麦芽糖或30％麦芽糖+5％葡萄糖为底物测定海藻糖合成酶酶活，并与未突变的海藻糖合成酶进行比较。海藻糖合成酶酶活测定方法：取破胞液0.6mL与0.6mL底物混匀，在37℃反应20min，反应液10000rpm离心3min取上清，按还原糖测定方法(3,5-二硝基水杨酸比色法)测定。对照用0.6mL0.2MpH6.5磷酸缓冲液代替酶液。海藻糖合成酶活力单位(U)定义为1mL酶液在37℃，pH6.5条件下，1分钟转化1ug麦芽糖生成海藻糖，即为1个酶活力单位，以U/mL表示。酶活力(U/ml)＝5000×(OD1-OD2)/OD1OD1---对照样测还原糖时的吸光值OD2---样品测还原糖的吸光值酶活测定结果显示，转化子23，65，67，98，147在两种底物中的酶活相对接近。将这些转化子进行测序，测序结果表明，转化子23，65和147发生了第286位的组氨酸替换为谷氨酰胺的突变，转化子67和98发生了第286位的组氨酸替换为天冬酰胺的突变。从转化子23，65和147中提取的质粒即为表达质粒pSE380-tcTreS-H286Q；从转化子67和98中提取的质粒即为表达质粒pSE380-tcTreS-H286N。3.含突变体酶基因的表达质粒pSE380-tcTreS-E339R的获得方法同上。一步反向PCR所用的引物为：引物PTE-L：5’-GGAGATGGTCACCGACNNNGAGCGGGACTACATG-3’引物PTE-R：5’-CATGTAGTCCCGCTCNNNGTCGGTGACCATCTCC-3’(N:dNTPs)测序结果表明，在两种底物中的酶活接近的转化子发生了第339位的谷氨酸替换为精氨酸的突变，提取而得的质粒即为pSE380-tcTreS-E339R。1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)的海藻糖合成酶的突变体，其特征在于，第286位的组氨酸替换为谷氨酰胺，或第286位的组氨酸替换为天冬酰胺，或第339位的谷氨酸替换为精氨酸；来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)的海藻糖合成酶的序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonosporacurvata)的海藻糖合成酶的突变体，其特征在于，第286位的组氨酸替换为谷氨酰胺，或第286位的组氨酸替换为天冬酰胺，或第339位的谷氨酸替换为精氨酸；来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonosporacurvata)的海藻糖合成酶的序列如SEQIDNO.1所示。2.一种获得海藻糖合成酶突变体的方法，其特征在于，对来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonosporacurvata)的海藻糖合成酶活性位点附近的氨基酸进行饱和突变，以含有葡萄糖的麦芽糖溶液为底物，快速筛选海藻...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓明，韦航，李丛，梁树华，谢能中，
申请(专利权)人：南宁中诺生物工程有限责任公司，
类型：发明
国别省市：广西,45