一种凝血酶的制备方法技术

本发明专利技术属于生化制药领域，具体涉及一种凝血酶的制备方法。本发明专利技术利用DEAE Sephadex A50凝胶吸附猪血浆预处理，提高了凝血酶的回收率，由于血浆属于复杂料液，除了含有血浆蛋白之外，还含有少量的血细胞或者碎片、脂肪或乳糜颗粒等不溶物，不溶物粒径大小不一，脂肪或乳糜微粒还导致血浆具有较大的粘度，选用Capto Heparin亲和凝胶，因其具有较高的效价回收率，耐压性强，然后进行超滤、病毒灭活，经离子交换层析，纳米膜过滤，一方面最大程度保证其中的病毒得到消除，提高使用的安全性，另一方面得到纯度较高的猪血浆液，排除杂质，为制备高纯度凝血酶提供基础。

【技术实现步骤摘要】
一种凝血酶的制备方法
本专利技术属于生化制药领域，具体涉及一种凝血酶的制备方法。
技术介绍
凝血酶是一种专一性很强的丝氨酸蛋白水解酶，它能水解血纤维蛋白原的肽键，产生不溶性的血纤维蛋白，使血液变成凝胶而发生凝固，使血液快速凝固、填塞出血点而达到止血的目的。由于其止血快，无副作用等优点，广泛应用于创伤和临床手术创面以及消化道粘膜等部位的出血与渗血，止血效果好，疗效确切。然而，普通凝血酶是一种蛋白酶类试剂，容易受光线、温度、湿度，特别是微生物的污染因素影响而导致生物活性下降甚至丧失。在常温下，凝血酶的水溶液在保存24天后就完全失活。稳定性较差，使其应用受到了一定限制。目前国内外主要从动物血浆及人血浆中制备凝血酶原，再经激活物激活而成为凝血酶。它可催化血纤维蛋白原中血纤维肽A和B的断裂，转变成不溶性血纤维蛋白凝块。凝血酶在临床上应用广泛，常以干粉或溶液局部涂于伤口及手术处，控制毛细血管血液渗出，多用于骨出血、扁桃腺摘除和拔牙时出血等。有时也可口服，用于胃和十二指肠出血。凝血酶局部止血效果好，且无副作用。目前凝血酶的应用范围正日渐扩大，由单纯的局部外敷发展到外科手术、耳鼻喉、口腔、妇产、泌尿及消化道等部位出血的止血，亦可作为多种外用止血药物的重要原料，其止血效果优于“对氨基苯甲酸”、“止血环酸”、“止血敏”等通过注射后须经血管收缩而起止血作用的药物。目前，临床上应用的凝血酶主要是由人血以及猪、牛等动物血分离提取的。其中，由于猪血来源充分，原料成本低等因素，所以大量凝血酶产品都是由猪血制备的，少量的是由人血及牛血等血液制备的。但是，不论是从动物血还是从人血制备的凝血酶产品，现有的制备方法都会存在以下几个问题：凝血酶产品效价不稳定；产品杂质及杂蛋白浓度偏高；存在引入各种病毒的风险，这些都会限制凝血酶产品的临床应用，并造成安全隐患。因此，我们有必要重新的设计制备出一种新型的凝血酶，以此来解决现如今市场上的凝血酶所存在的缺陷，以此来更好的适应于人们的生活需求。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题：针对目前凝血酶产品效价不稳定，产品杂质及杂蛋白浓度偏高，存在引入各种病毒的风险，这些都会限制凝血酶产品的临床应用，并造成安全隐患的问题，提供一种凝血酶的制备方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下所述的技术方案是：一种凝血酶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：（1）取鲜猪血浆经DEAESephadexA50凝胶吸附，过滤，取滤液A，用洗涤液洗涤CaptoHeparin亲和凝胶2~3次，得洗涤后亲和凝胶，取浓度为2mol/L的氯化钠溶液按质量比20：1加入浓度为20mmol/L的磷酸氢二钠溶液混合，得洗脱液，将滤液过洗涤后亲和凝胶进行亲和层析，用洗脱液进行洗脱，取层析洗脱液按质量比1：5加入浓度为20mmol/L的磷酸氢二钠溶液进行超滤，得超滤液；（2）取超滤液按质量比100：1~3：2~4加入聚山梨酯-80、质量分数为0.3%的磷酸三丁酯水溶液混合，于20~25℃保持4~6h，过CaptoQ凝胶进行离子交换层析，再经纳米滤膜过滤，取滤液B，得凝血酶基体液；（3）取凝血酶基体液按质量比10：1加入浓度为1.0mol/L的氯化钡溶液，于3~4℃搅拌混合30~40min，静置，离心，取沉淀用浓度为1.0mol/L的氯化钡溶液洗涤2~3次，取洗涤后沉淀按质量比1：5加入混合液，于3~4℃搅拌混合30~50min，离心，取上清液A按质量比5：8：2加入浓度为0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液、0.15mol/L的氯化钠溶液混合，静置，离心，得上清液B；（4）取上清液B按质量比10：3加入质量分数为2%的碳酸钠溶液搅拌混合，保持15~20min，再加入上清液质量20~30%的浓度为0.25mol/L的氯化钙溶液，保持1~2h，调节pH至7.0~7.2，静置，过滤，取滤液，得滤液C；（5）取乳香、没药、裸花紫珠叶按质量比2：2：1混合干燥，粉碎过100目筛，收集过筛颗粒按质量比1：10加入蒸馏水混合，于95~100℃保持1~2h，过滤，取滤液按质量比1：6加入正丁醇萃取，保持1~2h，取萃取液减压浓缩，得浓缩物，浓缩物按质量比2：5加入滤液C混合，冷冻干燥，得干燥粉末，即为凝血酶。所述步骤（1）中洗涤液为按质量份数计，取10~12份0.25mol/L的氯化钠溶液、3~4份20mmol/L的磷酸氢二钠溶液、1~2份10mmol/L的枸橼酸钠溶液混合，即得。所述步骤（3）中混合液为按质量份数计，取10~15份浓度为0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液、4~7份浓度为0.1mol/L的氯化钠溶液、2~3份EDTA二钠混合，pH7.2~7.4。本专利技术与其他方法相比，有益技术效果是：（1）本专利技术利用DEAESephadexA50凝胶吸附猪血浆预处理，提高了凝血酶的回收率，由于血浆属于复杂料液，除了含有血浆蛋白之外，还含有少量的血细胞或者碎片、脂肪或乳糜颗粒等不溶物，不溶物粒径大小不一，脂肪或乳糜微粒还导致血浆具有较大的粘度，选用CaptoHeparin亲和凝胶，因其具有较高的效价回收率，耐压性强，然后进行超滤、病毒灭活，经离子交换层析，纳米膜过滤，一方面最大程度保证其中的病毒得到消除，提高使用的安全性，另一方面得到纯度较高的猪血浆液，排除杂质，为制备高纯度凝血酶提供基础；（2）本专利技术利用柠檬酸钡能吸附依赖于维生素K的凝血因子这一特性，在柠檬酸钠抗凝获得的血浆中加入氯化钡产生柠檬酸钡，凝血酶原等因子随之沉淀分离出来，沉淀用EDTA解吸附，离心去沉淀，上清液经透析后获得凝血酶原溶液，虽然该方法看似操作较为复杂，但得到的凝血酶纯度较高，凝血酶原经单独的钙离子激活即可得到凝血酶，其过程效价稳定，凝血酶纯度得到较大的提高；（3）本专利技术添加乳香、没药、裸花紫珠为凝血酶辅助添加剂，其中的挥发油类物质对凝血具有协同增效的效果，其对血小板凝集进行诱导，促进活血化瘀，缩短凝血时间和出血时间，对凝血酶有辅助作用。具体实施方式DEAESephadexA50凝胶、CaptoHeparin亲和凝胶、CaptoQ凝胶：购于美国GE公司。洗涤液：按质量份数计，取10~12份0.25mol/L的氯化钠溶液、3~4份20mmol/L的磷酸氢二钠溶液、1~2份10mmol/L的枸橼酸钠溶液混合，即得。混合液：按质量份数计，取10~15份浓度为0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液、4~7份浓度为0.1mol/L的氯化钠溶液、2~3份EDTA二钠混合，pH7.2~7.4。一种凝血酶的制备方法，包括如下步骤：（1）取鲜猪血浆经DEAESephadexA50凝胶吸附，过滤，取滤液A，用洗涤液洗涤CaptoHeparin亲和凝胶2~3次，得洗涤后亲和凝胶，取浓度为2mol/L的氯化钠溶液按质量比20：1加入浓度为20mmol/L的磷酸氢二钠溶液混合，得洗脱液，将滤液过洗涤后亲和凝胶进行亲和层析，用洗脱液进行洗脱，取层析洗脱液按质量比1：5加入浓度为20mmol/L的磷酸氢二钠溶液进行超滤，得超滤液；（2）取超滤液按质量比100：1~3：2~4加入聚山梨酯-80、质量分数为0.3%的磷酸三丁酯水溶液混合，于20~25℃保持4~6h，过CaptoQ凝胶进行离子交换层析，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种凝血酶的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：取鲜猪血浆经DEAE Sephadex A50凝胶吸附，过滤，取滤液A，用洗涤液洗涤Capto Heparin亲和凝胶2~3次，得洗涤后亲和凝胶，取浓度为2mol/L的氯化钠溶液按质量比20：1加入浓度为20mmol/L的磷酸氢二钠溶液混合，得洗脱液，将滤液过洗涤后亲和凝胶进行亲和层析，用洗脱液进行洗脱，取层析洗脱液按质量比1：5加入浓度为20mmol/L的磷酸氢二钠溶液进行超滤，得超滤液；取超滤液按质量比100：1~3：2~4加入聚山梨酯‑80、质量分数为0.3%的磷酸三丁酯水溶液混合，于20~25℃保持4~6h，过Capto Q凝胶进行离子交换层析，再经纳米滤膜过滤，取滤液B，得凝血酶基体液；取凝血酶基体液按质量比10：1加入浓度为1.0mol/L的氯化钡溶液，于3~4℃搅拌混合30~40min，静置，离心，取沉淀用浓度为1.0mol/L的氯化钡溶液洗涤2~3次，取洗涤后沉淀按质量比1：5加入混合液，于3~4℃搅拌混合30~50min，离心，取上清液A按质量比5：8：2加入浓度为0.02mol/L的Tris‑HCl缓冲液、0.15mol/L的氯化钠溶液混合，静置，离心，得上清液B；取上清液B按质量比10：3加入质量分数为2%的碳酸钠溶液搅拌混合，保持15~20min，再加入上清液质量20~30%的浓度为0.25mol/L的氯化钙溶液，保持1~2h，调节pH至7.0~7.2，静置，过滤，取滤液，得滤液C；取乳香、没药、裸花紫珠叶按质量比2：2：1混合干燥，粉碎过100目筛，收集过筛颗粒按质量比1：10加入蒸馏水混合，于95~100℃保持1~2h，过滤，取滤液按质量比1：6加入正丁醇萃取，保持1~2h，取萃取液减压浓缩，得浓缩物，浓缩物按质量比2：5加入滤液C混合，冷冻干燥，得干燥粉末，即为凝血酶。...

【技术特征摘要】
1.一种凝血酶的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：取鲜猪血浆经DEAESephadexA50凝胶吸附，过滤，取滤液A，用洗涤液洗涤CaptoHeparin亲和凝胶2~3次，得洗涤后亲和凝胶，取浓度为2mol/L的氯化钠溶液按质量比20：1加入浓度为20mmol/L的磷酸氢二钠溶液混合，得洗脱液，将滤液过洗涤后亲和凝胶进行亲和层析，用洗脱液进行洗脱，取层析洗脱液按质量比1：5加入浓度为20mmol/L的磷酸氢二钠溶液进行超滤，得超滤液；取超滤液按质量比100：1~3：2~4加入聚山梨酯-80、质量分数为0.3%的磷酸三丁酯水溶液混合，于20~25℃保持4~6h，过CaptoQ凝胶进行离子交换层析，再经纳米滤膜过滤，取滤液B，得凝血酶基体液；取凝血酶基体液按质量比10：1加入浓度为1.0mol/L的氯化钡溶液，于3~4℃搅拌混合30~40min，静置，离心，取沉淀用浓度为1.0mol/L的氯化钡溶液洗涤2~3次，取洗涤后沉淀按质量比1：5加入混合液，于3~4℃搅拌混合30~50min，离心，取上清液A按质量比5：8：2加入浓度为0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液、0.15mol/L的氯化钠溶液混...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄旭东，郑薇，林凡，
申请(专利权)人：黄旭东，
类型：发明
国别省市：江苏,32