同型半胱氨酸甲基转移酶突变体及其应用、以及核酸、表达载体、宿主细胞、试剂制造技术

本发明专利技术采用易错PCR、定点突变的方法筛选出一种同型半胱氨酸甲基转移酶突变体，在野生型HMT的基础上在D53、D283、L252、Q219氨基酸处含有一处或两处以上氨基酸突变。该突变体的活性提高了一倍，稳定性也有所提高。本发明专利技术还公开了编码该同型半胱氨酸甲基转移酶突变体的核酸，包括所述核酸的表达载体、包括所述表达载体的宿主细胞，以及包括上述同型半胱氨酸‑S‑甲基转移酶突变体、核酸、表达载体、宿主细胞中的至少一种的试剂。

【技术实现步骤摘要】
同型半胱氨酸甲基转移酶突变体及其应用、以及核酸、表达载体、宿主细胞、试剂
本专利技术涉及一种酶及其应用，编码该酶的核酸，包括所述核酸的表达载体，包括所述表达载体的宿主细胞，以及包括上述酶、核酸、表达载体、宿主细胞中的至少一种的试剂。更具体地说，它涉及同型半胱氨酸甲基转移酶突变体及其应用、编码该同型半胱氨酸甲基转移酶突变体的核酸，包括所述核酸的表达载体、包括所述表达载体的宿主细胞，以及包括上述同型半胱氨酸甲基转移酶突变体、核酸、表达载体、宿主细胞中的至少一种的试剂。
技术介绍
甲基转移酶可催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）上的甲基转移到底物分子上，生成多种重要的含甲基的生理活性物质，达到功能调节的目的。同型半胱氨酸甲基转移酶（HMT，EC2.1.1.10）是甲基转移酶中的一种，可催化同型半胱氨酸和SAM反应生成S-腺苷同型半胱氨酸和甲硫胺酸，可用于配制同型半胱氨酸（HCY）生化诊断试剂，是一种关键原料酶。现有HMT为酿酒酵母SAM4氨基酸序列，活性低、稳定性差。针对以上问题，中国专利技术专利CN102391999B公开了一种同型半胱氨酸甲基转移酶及其核苷酸序列、重组载体、重组宿主细胞及制法和试剂盒，从白色念珠菌(CandidaalbicansSC5314)中得到具有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的同型半胱氨酸甲基转移酶，并且利用随机突变的方法得到具有SEQIDNO：3所示的氨基酸序列的同型半胱氨酸甲基转移酶。所得两种同型半胱氨酸甲基转移酶都具有很好的耐热性，能在宽的温度范围内保持较高的稳定性。两种同型半胱氨酸甲基转移酶在40℃下于pH6.0的缓冲液中静置15分钟后仍都具有60％以上的相对活性。但是上述方案中的同型半胱氨酸甲基转移酶仅仅提高了耐热性，但是酶经常要在4℃需要放置数月甚至按年来计算，40℃高温稳定性一定要好，而上述方案中40℃、15min后仅有60%的相对活性还是比较低的，而且整体的活性还是相对较低。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的一在于提供一种同型半胱氨酸甲基转移酶突变体，显著提高了酶的耐热性、活性和稳定性。本专利技术的上述技术目的一是通过以下技术方案得以实现的：一种同型半胱氨酸甲基转移酶突变体，在野生型HMT的基础上在D53、D283、L252、Q219氨基酸处含有一处或两处以上氨基酸突变，且在D53、D283、L252、Q219突变的氨基酸为不包括原氨基酸的19种氨基酸中的任一种氨基酸。通过采用上述技术方案，通过理论知识和经验，选取了在特定氨基酸位置上进行定向突变，与野生型（WT）相比，突变体的活性和稳定性都有一定的提高，而且耐热性也得到了提高。本专利技术进一步设置为：同型半胱氨酸甲基转移酶突变体在D53、D283氨基酸处突变为谷氨酸、天冬酰胺或甘氨酸。本专利技术进一步设置为：同型半胱氨酸甲基转移酶突变体在D53氨基酸处突变为谷氨酸，D283氨基酸处突变为天冬酰胺。本专利技术进一步设置为：同型半胱氨酸甲基转移酶突变体在L252氨基酸处突变为异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸或赖氨酸；同型半胱氨酸甲基转移酶突变体在Q219氨基酸处突变为谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺。本专利技术进一步设置为：同型半胱氨酸甲基转移酶突变体在其他位置氨基酸处含有氨基酸突变。本专利技术的目的二在于提供一种核酸，编码获得的同型半胱氨酸甲基转移酶突变体相对于野生型HMT的活性和稳定性都得到了显著提高。本专利技术的上述技术目的二是通过以下技术方案得以实现的：一种编码同型半胱氨酸甲基转移酶突变体的核酸，所述核酸为编码上述方案中所述的同型半胱氨酸甲基转移酶突变体的核酸。本专利技术的目的三在于提供一种表达载体，表达载体中含有的同型半胱氨酸甲基转移酶突变体相对于野生型HMT的活性和稳定性都得到了显著提高。本专利技术的上述技术目的三是通过以下技术方案得以实现的：一种表达载体，包含上述方案中所述的核酸的表达载体。本专利技术的目的四在于提供一种宿主细胞，宿主细胞中含有的同型半胱氨酸甲基转移酶突变体相对于野生型HMT的活性和稳定性都得到了显著提高。本专利技术的上述技术目的四是通过以下技术方案得以实现的：一种宿主细胞，包含上述方案中所述表达载体的宿主细胞。本专利技术进一步设置为：所述宿主细胞为原核细胞。本专利技术进一步设置为：所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。本专利技术进一步设置为：所述宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3）细胞。本专利技术的目的五在于提供同型半胱氨酸甲基转移酶突变体的应用，催化S-腺苷甲硫氨酸与同型半胱氨酸反应生成S-腺苷同型半管氨酸和甲硫氨酸效率更高。本专利技术的上述技术目的五是通过以下技术方案得以实现的：上述方案中同型半胱氨酸-S-甲基转移酶突变体催化S-腺苷甲硫氨酸与同型半胱氨酸反应生成S-腺苷同型半管氨酸和甲硫氨酸的应用。一种同型半胱氨酸检测试剂，该试剂含有上述方案中所述的同型半胱氨酸甲基转移酶突变体。通过采用上述技术方案，可以减少HMT用量及延长Hcy试剂的使用期限，从而降低生产成本，减少定标次数，增加试剂的有效检测数量。综上所述，本专利技术具有以下有益效果：其一、本专利技术是将编码HMT的核酸序列按照大肠杆菌密码子偏好进行优化并合成，相对比于野生菌来源的序列，优化后的基因序列更有利于在大肠杆菌中表达，表达量高而且重组质粒稳定，重复性好且不宜丢失。其二、经过多轮的试验，进行了大量的组合，检测酶活性和稳定性，结果表明D283氨基酸处突变为天冬酰胺、L252氨基酸处突变为异亮氨酸和Q219氨基酸处突变为天冬氨酸这3个位置同时突变时，得到了酶活性、稳定性都得到明显提高的突变体，最终酶活性提高了一倍，稳定性也有极大提高，从野生型的75%提高到90%左右。其三、本专利技术经过优选，选取了pET-28a(+)表达载体、选取了BL21（DE3）细胞进行表达，pET系列的载体，带有T7启动子，T7表达系统可使用强力的噬菌体T7启动子进行高水平表达。它非常适用于在大肠杆菌中表达可溶的无毒性重组蛋白质。本专利技术得到的pET-28a-HMT在进行表达时得到了明显的高水平表达。T7RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，非常适用于T7、T7Lac启动子的表达系统，如pET、pEASY等。上述本专利技术优选了pET-28a系列的表达载体，配对BL21（DE3）表达细胞，是非常利于HMT蛋白的可溶性高表达量的表达。经过优化后的载体和细胞的组合通过试验得到了可溶性的、高水平表达的目的蛋白。其三、本专利技术直接采用Hcy检测试剂盒的原理，经过组合后反过来检测HMT的活性，使得该酶在Hcy试剂盒中活性高低变化对试剂盒的影响更为直接，这样会避免单纯的酶活性检测和酶在试剂盒中活性检测的不一致的问题，简单说，试剂盒成分复杂，简单酶活性检测说明酶活性高了是不能直接说明在试剂盒中实际应运的时候就一定能提高整个试剂盒的活性的。最终，一系列的试验说明了可以在减少HMT用量的同时延长Hcy试剂的使用期限，从而降低生产成本，减少定标次数，增加试剂的有效检测数量。具体实施方式本专利技术SEQIDNO.1为来源于酿酒酵母的HMT氨基酸序列，SEQIDNO.2为本专利技术优化的HMT核苷酸序列，序列表见表5。SEQIDNO.3-17为本专利技术的HMT突变体氨基酸序列。本专利技术是将酿酒酵母来源的HMT如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同型半胱氨酸甲基转移酶突变体，其特征在于：在野生型HMT的基础上在D53、D283、L252、Q219氨基酸处含有一处或两处以上氨基酸突变，且在D53、D283、L252、Q219突变的氨基酸为不包括原氨基酸的19种氨基酸中的任一种氨基酸。

【技术特征摘要】
1.一种同型半胱氨酸甲基转移酶突变体，其特征在于：在野生型HMT的基础上在D53、D283、L252、Q219氨基酸处含有一处或两处以上氨基酸突变，且在D53、D283、L252、Q219突变的氨基酸为不包括原氨基酸的19种氨基酸中的任一种氨基酸。2.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸甲基转移酶突变体，其特征在于：同型半胱氨酸甲基转移酶突变体在D53、D283氨基酸处突变为谷氨酸、天冬酰胺或甘氨酸。3.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸甲基转移酶突变体，其特征在于：同型半胱氨酸甲基转移酶突变体在L252氨基酸处突变为异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸或赖氨酸；同型半胱氨酸-S-甲基转移酶突变体在Q219氨基酸处突变为谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺。4.一种编码同型半胱氨酸甲基...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭毅，王晓霞，
申请(专利权)人：苏州汇桢生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32