一种单加氧酶复合体及其在手性亚砜合成中的应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域的一种单加氧酶复合体，所述的单加氧酶蛋白复合体由四个亚基组成，其氨基酸残基序列如SEQ ID No.1所示。利用所述的单加氧酶复合体能制备高光学纯度的(R)构型亚砜。相对于其它现有的制备方法，使用所述制备方法反应时间短，反应条件温和，对环境友好，操作简便。

【技术实现步骤摘要】
一种单加氧酶复合体及其在手性亚砜合成中的应用
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种单加氧酶复合体及其在手性亚砜合成中的应用。
技术介绍
手性亚砜是一类非常重要的化合物，可作为手性中间体和辅剂、手性配体、催化剂以及临床药物，在有机合成和药物合成中有广泛的应用。现有的手性亚砜合成技术还存在着过度氧化、副产物多、反应条件苛刻等不足。生物酶的高效和高选择性，使得生物催化技术可望发展成为工业化绿色制备手性亚砜类药物的新途径。但现有研究表明，高活性和高对映选择性的手性亚砜合成酶还十分匮乏，无法满足绿色工业化生产的需求，获得高催化效率的生物酶和相应的生物催化合成方法，仍然是手性亚砜生物催化制备发展过程中的难点和瓶颈。
技术实现思路
本专利技术旨在克服上述缺点，提供一种高催化活性的单加氧酶复合体，以及该单加氧酶复合体在手性亚砜生物催化合成中的应用。为了达到上述目的，本专利技术提供如下基础技术方案：单加氧酶复合体pmTod，包含4个亚基，命名为：pmTodA，pmTodB，pmTodC，pmTodD；其氨基酸残基序列如SEQIDNo.1所示。pmTod是该单加氧酶复合体的英文解释。本专利技术所涉及的单加氧酶复合体(pmTod)是从实验室保存的菌种中分离获得，获得的方法为本领域常规方法；较佳地为从重组表达pmTod的基因工程菌中分离获得或者人工合成获得。以下是对基础技术方案的优化：优化方案一：所述单加氧酶复合体为具有催化硫醚底物生成(R)-亚砜的蛋白质。优化方案二：包含上述基础方案或者优化方案一的单加氧酶复合体的蛋白质编码基因。优化方案三，基于优化方案二：所述蛋白质编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术所述的单加氧酶复合体pmTod基因是从本实验室保存的菌种中克隆获得，获得的方法为本领域常规；较佳地为提取菌株基因组DNA，通过PCR扩增获得，或者根据SEQIDNo.2所示核苷酸序列人工合成获得。优化方案四，包含优化方案二的蛋白质编码基因的重组表达载体。优化方案五，包含优化方案三的蛋白质编码基因的重组表达载体。本专利技术所述重组表达载体由通过本领域常规方法将所述pmTod基因连接于各种骨架载体上构建而成；较佳地，可通过下述方法制得：将通过PCR所得的pmTodA和pmTodB基因和骨架载体pET-Dute-1连接形成重组载体pETDute1-pmTodA-B，将通过PCR所得的pmTodC和pmTodD基因和骨架载体pRSF-Dute-1连接形成重组载体pRSFDute1-pmTodC-D。优化方案六，包含优化方案四或优化方案五中所述重组载体的基因工程菌。本专利技术所述基因工程菌由通过本领域常规方法将所述重组表达载体转化至宿主微生物中制得；所述宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足所述重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的亚砜还原酶基因可被有效表达即可；较佳地，可通过下述方法制得：将重组载体pETDute1-pmTodA-B与pRSFDute1-pmTodC-D转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。本专利技术还提供了基础方案所述的单加氧酶复合体在手性亚砜制备中的应用，表达如权利要求1所述单加氧酶复合体，将其悬浮于反应缓冲液中，加入硫醚底物，放入摇床反应后，再加入乙酸乙酯萃取并收集有机相，通过柱层析分离获得(R)构型的手性亚砜。优化方案七，基于上述单加氧酶复合体在手性亚砜制备中的应用，其特征在于：所述缓冲液为50mM浓度、pH6～9的磷酸钠缓冲液；所述的摇床转速为200-250rpm/min；反应温度为25～35℃；反应时间为12～24小时；所述的硫醚底物浓度为2～8mM。优化方案八，所述单加氧酶复合体可以为纯化后的重组酶蛋白，含重组酶蛋白的粗酶液和含重组酶蛋白的基因工程菌休止细胞、基因工程菌生长期细胞、基因工程菌固定化细胞中的一种。本专利技术的积极进步效果在于：利用所述的单加氧酶复合体能制备高光学纯度的(R)构型亚砜。相对于其它现有的制备方法，使用所述制备方法反应速率高，耗时短；所述制备方法可在常温、常压及水相环境中进行，反应条件温和，且所述制备方法不需使用强氧化剂或有毒试剂，因此具有较高的催化活性，对环境友好，操作简便。含重组单加氧酶复合体的基因工程菌催化消旋体亚砜底物制备手性亚砜的反应过程为：附图说明图1为本专利技术的单加氧酶复合体重组表达质粒的示意图；图2为pmTod重组蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图片；泳道1为蛋白质分子量标志；泳道2为pmTod重组蛋白的表达情况，箭头所示为pmTod复合体的4个亚基条带。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本专利技术，但并不因此将本专利技术限制在所述实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例1：单加氧酶复合体基因的获得，包括以下步骤：以基因组DNA为模板，使用引物1：5’-GGCCAGATCTCATGAATCAGACCGACACATC-3’和2：5’-AATTCTCGAGGCGTGTCGCCTTCAGCGCG-3’进行PCR扩增获得pmTodA基因；使用引物3：5’-GGAAGGATCCGATGATTGATTCAGCCAACAG-3’和4：5’-AACCGTCGACCTAGAAGAAGAAACTGAGG-3’进行PCR扩增获得pmTodB基因；使用引物5：5’-GGCCAGATCTATGGCGTTGCCCGGCAGCC-3’和6：5’-AATTCTCGAGACGTTAGGTCTCCTTCATTCG-3’进行PCR扩增获得pmTodC基因；使用引物7：5’-GGAAGGATCCATGACTTGGACATACATATT-3’和8：5’-AACCGTCGACCTTCAACTCCCCGTTGTCG-3’进行PCR扩增获得pmTodD基因。PCR反应体系如下：2×TaqPCRMasterMix10.0μL、基因组DNA1μL、上下游引物各0.5μL、ddH2O8.0μL。PCR反应条件：95℃10min；98℃10s，58℃30s，72℃30s，30个循环循环；72℃延伸5min。PCR产物以1％琼脂糖凝胶电泳验证是否获得符合目的基因大小的片段。实施例2：单加氧酶复合体基因工程菌的构建，包括以下步骤：用限制性内切酶BamHI和SalI对含有pmTodA基因序列的DNA片段及载体pETDute-1进行双酶切，酶切回收的目的片段和载体。用T4DNA连接酶，16℃连接4h后，连接产物转化大肠杆菌DH5α。过夜培养后，挑取长出的单克隆菌落摇菌并提取质粒，利用BamHI和SalI对重组质粒pETDute1-pmTodA进行双酶切检测。接着，接着用BglII和XhoI对pmTodB基因及重组质粒pETDute1-pmTodA进行同样的操作后，获得重组载体pETDute1-pmTodA-B。接着，用限制性内切酶BamHI和SalI对含有pmTodC基因序列的DNA片段及载体pRSFDute-1进行双酶切，用T4DNA连接酶连接后，连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得重组质粒pRSFDute1-pmTodC进行双酶切检测。接着，接着用BglII和XhoI对pmTodD基因及重组质粒pRSFDute1-pmTodC进行同样的操作后，获得重组载体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单加氧酶复合体，其特征在于：所述的单加氧酶蛋白复合体由四个亚基组成，其氨基酸残基序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种单加氧酶复合体，其特征在于：所述的单加氧酶蛋白复合体由四个亚基组成，其氨基酸残基序列如SEQIDNo.1所示。2.根据权利要求1所述的单加氧酶复合体，其特征在于：所述单加氧酶复合体为具有催化硫醚底物生成(R)-亚砜的蛋白质。3.一种包含如权利要求1或2所述的单加氧酶复合体的蛋白质编码基因。4.如权利要求3所述的蛋白质编码基因，其特征在于：所述蛋白质编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。5.一种包含如权利要求3所述的蛋白质编码基因的重组表达载体。6.一种包含如权利要求4所述的蛋白质编码基因的重组表达载体。7.一种包含如权利要求3或4所述的重组载体的基因工程菌。8.如权利要求1所述的单加氧酶复合体在手性亚砜制备中的应用，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨加伟，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州,52