一条抑制猪瘟病毒感染活性的多肽及其应用制造技术

本发明专利技术一条抑制猪瘟病毒感染活性的多肽及其应用，该多肽序列为KRWWSHK(P8)。本发明专利技术以牛病毒性腹泻病毒E2蛋白晶体结构为模板，同源建模获得猪瘟病毒E2蛋白的三维结构，借助虚拟分子对接技术，最终获得一条具有高评分值的多肽序列，即为P8；人工合成P8序列采用ELISA及SPR试验鉴定其与E2蛋白相互作用的亲和性及特异性，结果显示P8与E2具有较高亲和性及特异性结合；然后通过qRT‑PCR及IPMA试验验证其抑制病毒感染的活性，结果表明P8序列具有较好抑制猪瘟病毒感染PK‑15细胞的活性。本发明专利技术可为进一步研究病毒受体及抗病毒药物设计提供可靠的理论依据及新的思路。

【技术实现步骤摘要】
一条抑制猪瘟病毒感染活性的多肽及其应用
本专利技术涉及一条抑制猪瘟病毒感染活性的多肽及其应用，具体涉及靶向猪瘟病毒E2蛋白多肽的设计及其抗猪瘟病毒感染活性的研究，属于多肽设计及抗病毒感染研究领域。
技术介绍
随着基因组学及蛋白质组学的迅猛发展，越来越多生物大分子的三维结构被解析，截止2017年1月，已经有超过12万个晶体结构被导入蛋白质数据库中。基于氨基酸序列分析的同源建模方法的进一步深入研究，对于某些在现有技术水平下无法解析其结构的生物大分子而言，也可通过建模的方式来分析其三维结构，这就大大拓展了基于结构分析的蛋白质研究范围。计算机辅助多肽设计技术的飞速发展，使得蛋白质与其配基多肽之间相互作用的研究更加精细与深入。计算机虚拟辅助设计可以实现氨基酸残基更加自由的突变，尤其是分子动力学的发展及新的更加精准的分子对接方法的出现，对于多肽筛选工作而言，不仅操作方便快捷，降低多肽筛选的强度及缩短研发周期，还大大地提升了筛选成功率。猪瘟(Classicalswinefever，CSF)是由猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CSFV)引起的一种高致病力、高死亡率的接触性传染病。该病在我国一直流行，且以地区散发性为主；尽管各大养殖场对CSF给予极大的关注，但由于不科学的免疫程序、参差不齐的疫苗质量及猪群不规范的饲养条件等，致使当前CSF仍然严重威胁着我国的养猪业。E0、E1及E2是CSFV的三个囊膜糖蛋白，其中E2是病毒最主要的抗原蛋白，同时E2也在CSFV与宿主细胞的相互识别及吸附过程中起重要介导作用；因此，E2蛋白的深入研究，对于探讨CSF的感染机制及新型疫苗的设计都具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一条抑制猪瘟病毒感染活性的多肽及其应用，该多肽与E2蛋白具有良好的亲和性及特异性结合，且对CSFV感染PK-15细胞具有较好的抑制活性。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一条抑制猪瘟病毒感染活性的多肽，所述多肽的序列为KRWWSHK。还包括所述的多肽序列为核心，任何对多肽序列进行的相应调整或修饰，修饰材料包括但不限制在纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定的蛋白质上。一种多肽在制备猪瘟病毒或者牛病毒性腹泻病毒检测试剂盒中的应用。检测试剂盒为用于酶联免疫吸附试验检测。一种多肽在制备抑制猪瘟病毒或者牛病毒性腹泻病毒感染药物方面的应用。与现有技术相比，本专利技术有益效果：(1)本专利技术借助虚拟分子对接技术，设计靶向CSFVE2蛋白的多肽，其序列为KRWWSHK，即为P8。人工合成P8，利用酶联免疫吸附试验(ELISA)及等离子体共振试验(SPR)鉴定其亲和性及特异性；之后通过荧光定量PCR(qRT-PCR)及免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)评价P8抑制CSFV感染PK-15细胞的活性，结果显示P8与E2蛋白具有良好的亲和性及特异性结合，平衡解离常数(KD)值为771nM。由此表明，借助本专利技术设计而成的多肽序列可以用于CSFV感染机理及抗病毒药物设计的研究。(2)本专利技术以同源建模的CSFVE2结构为基础设计的多肽序列，结构简单、性质稳定、无免疫原性、易于合成及修饰，能够有效结合CSFVE2蛋白的活性位点，发挥一定的抑制病毒感染作用，结果显示，P8对CSFV感染PK-15细胞具有较好的抑制活性，抑制率高达75％以上，可为CSFV感染机理及抗病毒药物设计研究提供理论指导和新的思路。(3)本专利技术设计而成的P8序列与人工表达纯化的CSFVE2蛋白具有良好的亲和性结合，除与BVDVE2蛋白反应较高外，与其它病毒蛋白均不发生交叉性反应，特异性较好。(4)本专利技术与传统噬菌体多肽筛选相比，具有操作简单，筛选强度低，研发周期短，生产成本低等特点，通过计算机辅助实施分子对接，可为实现CSFV受体研究及E2蛋白结构功能解析提供较好的理论指导。附图说明图1为P8与CSFVE2蛋白的对接结果展示。图2为P8与人工表达CSFVE2蛋白的SPR亲和力鉴定结果。图中，曲线从上至下依次为317.47μM、158.73μM、79.36μM、9.92μM、4.96μM、2.48μM。图3为P8与人工表达CSFVE2蛋白的ELISA鉴定结果。图4为P8抑制CSFV感染PK-15细胞的qRT-PCR鉴定结果。图5为P8抑制CSFV感染PK-15细胞的IPMA鉴定结果。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。实施例1、分子对接及虚拟肽库的筛选1、E2蛋白的准备从PDB数据库中搜寻牛流行性腹泻病毒E2蛋白的晶体结构(4JNT)，借助计算机程序对晶体结构进行分析，选定其第800到900氨基酸残基作为对接设定区域，以进行分子对接。2、虚拟多肽库的设计建立不同氨基酸残基的空间结构，借助计算机程序，实现对输入目标多肽进行批量生成，以满足分子对接计算机程序的自动调用和处理。虚拟多肽库均以直链形式生成，不对任何侧链和首尾氨基和羧基进行修饰。单一虚拟多肽库的生成以不超过四位氨基酸残基为宜。3、对接结果的评断分别计算多肽与蛋白结合的自由能，氢链，范德华力等力学参数进行综合评定，以此来判定筛选结果，并筛选得到多肽P8，其序列为KRWWSHK(Lys-Arg-Trp-Trp-Ser-His-Lys)(SEQIDNO.1)，其与CSFVE2蛋白对接的相互作用位置结果见图1。实施例2、P8与人工表达E2蛋白的亲和力鉴定(SPR)1、将纯化的CSFVE2蛋白用PBS缓冲液稀释为1μg/mL(蛋白量计)，采用EDC/NHS活泼酯法，分别将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)、CSFVE2蛋白注入安装有氨基芯片的SPR传感器中，保证EDC/NHS和E2蛋白分别与氨基芯片相互作用5min，实施CSFVE2蛋白与氨基芯片的偶联。偶联完成后，该传感器就可以用于测量CSFVE2蛋白与P8之间的相互作用。2、向传感器中注入250μLPBS缓冲液(pH7.4)，以最大流速(150μL/min)运行PBS缓冲液，达到信号基线，将PBS缓冲液的流速降至20μL/min，以获得较为稳定的基线。3、将合成的P8用PBS缓冲液稀释为不同的浓度，从低浓度开始依次向传感器中注入250μL多肽溶液，每次注入样品均采用20μL/min的流速并且与传感器相互作用5min，PBS缓冲液冲洗5min。在每一个浓度循环结束后，250μL0.25％SDS溶液被注入用于解离结合在CSFVE2蛋白上的P8。最终以得到的不同浓度多肽溶液与CSFVE2蛋白相互作用的结合与解离曲线为依据，在TraceDrawerTM软件上对P8和CSFVE2蛋白进行亲和力分析。结果表明，P8与人工表达的CSFVE2蛋白具有较好的亲和性结合，两者之间相互作用的平衡解离常数KD值为7.71×10-7M，即771nM。(见图2)。实施例3、P8与人工表达E2蛋白的ELISA鉴定1、将人工表达纯化的CSFVE2蛋白以1μg/mL(蛋白量计)进行酶标板包被；以同样方式将不同病毒表达纯化的蛋白，即牛病毒性腹泻病毒E2蛋白(BVDV-E2)、乙脑病毒E2蛋白(JEV-E2)、圆环病毒Cap蛋白(PCV-Cap)、伪狂犬病毒gE蛋白(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一条抑制猪瘟病毒感染活性的多肽，其特征在于，所述多肽的序列为KRWWSHK。

【技术特征摘要】
1.一条抑制猪瘟病毒感染活性的多肽，其特征在于，所述多肽的序列为KRWWSHK。2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，包括所述的多肽序列为核心，任何对多肽序列进行的相应调整或修饰，修饰材料包括但不限制在纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定的蛋白质上。...

【专利技术属性】
技术研发人员：王方雨，张改平，邓瑞广，余秋颖，邢广旭，郝慧芳，孙亚宁，赵东，柴书军，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：河南,41