一种HPPH的纯化方法技术

本发明专利技术提供了一种HPPH(2‑((1′‑正己氧基)乙基)‑2‑二乙烯基‑焦脱镁叶绿酸(a)，2‑((1’‑n‑hexyloxy)ethyl)‑2‑divinyl‑pyropheophorbide‑a)的纯化方法，具体涉及一种HPPH的制备色谱纯化方法，通过该方法纯化后，HPPH样品纯度(HPLC，归一化法)可以高达99.92％，单个杂质含量小于0.10％。

【技术实现步骤摘要】
一种HPPH的纯化方法
本专利技术涉及一种纯化方法，具体涉及一种HPPH的制备色谱纯化方法。
技术介绍
HPPH，全称2-((1′-正己氧基)乙基)-2-二乙烯基-焦脱镁叶绿酸(a)，英文名为2-((1’-n-hexyloxy)ethyl)-2-divinyl-pyropheophorbide-a)，是一种新型肿瘤光动力治疗(PDT)药物—光敏剂，由美国RoswellPark肿瘤研究所研发，目前已经完成Ⅱ期临床试验。HPPH在407nm和665nm有很强的吸收，并且具有高的单重态氧量子产率，被认为是最高效且最具发展前途的光敏剂，其结构式如下：在临床研究中，HPPH是通过静脉注射进入人体，经过血液循环，逐渐到达人体的各个组织、器官和肿瘤细胞中的。因此，原料药中杂质含量的高低直接关系到光敏剂HPPH的毒副作用的大小和安全窗口的大小。杂质含量越低，副作用越小、安全性越高。对于半合成产品来说，反应复杂，生成的副产物多，纯化困难；特别是通过半合成方法制备的光敏剂，反应生成的副产物和光降解的杂质就更复杂，经过硅胶柱层析和重结晶后，纯度很难达到99.5％，最大单个杂质含量也远远大于0.10％，而最大单个杂质含量的高低直接影响产品的质量、销售价格和产品竞争力。通过专利US5198460A或专利US20040044198A1工艺路线制备，经过硅胶柱层析和结晶得到的HPPH样品，我们检测其HPLC纯度(归一化法)在93％-99％之间。专利CN104193753A报道了一种由红豆杉枝叶提取物制备光敏剂HPPH的方法。在该专利中，半合成工艺路线与专利US20040044198A1的工艺路线一致；纯化方法是通过硅胶柱层析(二氯甲烷→二氯甲烷-1.5％甲醇梯度洗脱)，得到纯度为97％的样品，再以甲醇为溶剂进行重结晶，得到纯度99％左右的样品。该专利纯化方法中存在一个很大缺陷：在硅胶柱层析纯化和结晶时，都使用了甲醇。HPPH本身是酸，在柱层析和结晶时，不可避免地会与甲醇反应，生成HPPH-甲酯(成品中的杂质)。我们按专利CN104193753A的纯化方法，硅胶柱层析时，以洗脱剂(二氯甲烷→二氯甲烷-1.5％甲醇)进行梯度洗脱，仅得到了纯度为91.64％的样品，HPPH-甲酯的含量为1.57％；接着以甲醇为结晶溶剂进行结晶，最后得到的样品的纯度为94.27％，HPPH-甲酯的含量为0.59％，最大单杂含量为2.52％。同时，我们还考察了其他的结晶体系，结晶后的纯度都小于99％。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，获得高质量的HPPH样品(纯度大于99.5％，杂质总含量小于0.50％，单个杂质含量小于0.10％)，本专利技术采用制备色谱技术，从上样量、洗脱剂体系、洗脱条件和收集洗脱液范围等方面对HPPH粗品(在本专利中，HPPH粗品是指纯度在93％～99％之间的HPPH样品)进行了纯化研究，该纯化方法可以获得纯度高达99.92％，杂质总含量远远小于0.50％，单个杂质含量小于0.10％的样品。一种HPPH的纯化方法，包括以下步骤：采用制备色谱法对HPPH粗品(在本专利中，HPPH粗品是指纯度在93％～99％之间的HPPH样品)进行分离纯化，当主成份出峰的上升电信号值(单位：mV或mAU)达到开始收集洗脱液的电信号值时，开始收集洗脱液，当主成份出峰的下降电信号值达到停止收集洗脱液的电信号值时，停止收集洗脱液；将收集到的洗脱液浓缩，得到浓缩液；浓缩液用萃取溶剂进行萃取，得到萃取液；将萃取液进行干燥、抽滤、浓缩，得到HPPH纯品(在本专利中，HPPH纯品是指纯度大于99.5％的HPPH样品)。作为优选，所述制备色谱法的色谱柱的类型为C18或C8反相硅胶填料色谱柱，优选为C18反相硅胶填料色谱柱。作为优选，所述制备色谱法的色谱柱的直径为20毫米-300毫米，优选100毫米。作为优选，所述制备色谱法分离纯化采用的流动相为无机盐、极性有机溶剂与水组成的三元流动相，按体积比计算，所述极性有机溶剂:水＝40:60～99:1，优选60:40～95:5。作为进一步优选技术方案，所述极性有机溶剂为丙酮、乙腈和四氢呋喃中的一种，优选为乙腈和丙酮中的一种。作为进一步优选技术方案，所述无机盐是指磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、乙酸铵和甲酸铵中的一种，优选为磷酸氢二钾、甲酸铵和乙酸铵中的一种；所述无机盐在流动相中的浓度是1～50mmol/L，优选为5～20mmol/L。作为优选，所述制备色谱法分离纯化采用的流动相为酸、极性有机溶剂与水组成的三元流动相，按体积比计算，极性有机溶剂:水＝40:60～99:1，优选60:40～95:5。作为进一步优选技术方案，所述极性有机溶剂为丙酮、乙腈和四氢呋喃中的一种，优选为乙腈和丙酮中的一种。作为进一步优选技术方案，所述酸是指磷酸、甲酸、三氟乙酸和乙酸中的一种，优选为磷酸、甲酸和三氟乙酸中的一种；所述酸在流动相中的体积百分比为0.01～1％，更优选为0.1％～0.5％。作为优选，所述HPPH粗品(在本专利中，HPPH粗品是指纯度在93％～99％之间的HPPH样品)，上样前，先加入极性有机溶剂溶解，然后再加入水，摇匀得到上柱液；所述HPPH粗品与极性有机溶剂的重量体积比为0.0125g/ml～0.05g/ml；所述HPPH粗品与水的重量体积比为0.1g/ml～1g/ml。作为进一步优选技术方案，所述极性有机溶剂为丙酮、乙腈和四氢呋喃中的一种，优选为乙腈和丙酮中的一种。作为优选，所述HPPH粗品的纯度(归一化法)在93％～99％之间，用量为0.1～2.5克/次/100毫米柱子，优选为1.2～2.0克/次/100毫米柱子，这里的克/次/100毫米柱子是指一次色谱柱(直径为100毫米的柱子)分离的量；其它直径的柱子每次分离的量按此比例放大或缩小。作为优选，所述制备色谱法分离纯化的检测波长为410nm，所述制备色谱法分离纯化的进样流速为20～200mL/min，优选为100～150mL/min；所述制备色谱法分离纯化的洗脱流速为200～350/min，优选为250～300/min。作为优选，所述制备色谱法分离纯化的开始收集洗脱液的电信号值是指开始收集洗脱液时的主成份出峰的上升电信号值，为500mV～1600mV，优选上升电信号值为600mV～1500mV；所述停止收集洗脱液的电信号值是指停止收集洗脱液时的主成份出峰的下降电信号值，为1600mV～500mV，优选下降电信号值为1200mV～600mV。作为优选，所述洗脱液的浓缩及萃取液的浓缩均为减压浓缩，所述减压浓缩的温度为0℃～40℃，优选10℃～30℃；所述减压浓缩的真空度为-0.095MPa～-0.06MPa，优选为-0.095MPa～-0.085MPa。作为优选，所述的萃取溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿中的一种，优选为乙酸乙酯或二氯甲烷中的一种；所述萃取溶剂的体积用量是浓缩液的1～10倍，优选为2～5倍。HPPH是通过从植物(比如：红豆杉枝叶)或藻类(比如：蓝藻或螺旋藻)中提取，得到叶绿素(a)，然后经过半合成工艺路线制备得到的。这使得杂质结构与HPPH的结构极其相似，导致它们在各种溶剂中的溶解度相近，很难通过硅胶柱层析和结晶方法来除掉杂质。比如，纯度为97.0％的HPPH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HPPH的纯化方法：其特征在于采用制备色谱法对HPPH粗品进行分离纯化，当主成份出峰的上升电信号值达到开始收集洗脱液的电信号值时，开始收集洗脱液；当主成份出峰的下降电信号值达到停止收集洗脱液的电信号值时，停止收集洗脱液；将收集到的洗脱液浓缩，得到浓缩液；浓缩液用萃取溶剂进行萃取，得到萃取液；将萃取液进行干燥、抽滤、浓缩，得到HPPH纯品。

【技术特征摘要】
1.一种HPPH的纯化方法：其特征在于采用制备色谱法对HPPH粗品进行分离纯化，当主成份出峰的上升电信号值达到开始收集洗脱液的电信号值时，开始收集洗脱液；当主成份出峰的下降电信号值达到停止收集洗脱液的电信号值时，停止收集洗脱液；将收集到的洗脱液浓缩，得到浓缩液；浓缩液用萃取溶剂进行萃取，得到萃取液；将萃取液进行干燥、抽滤、浓缩，得到HPPH纯品。2.根据权利要求1所述的一种HPPH的纯化方法，其特征在于所述制备色谱法的色谱柱类型为C18或C8反相硅胶填料色谱柱，优选为C18反相硅胶填料色谱柱。3.根据权利要求1所述的一种HPPH的纯化方法，其特征在于所述制备色谱法的色谱柱的直径为20毫米-300毫米，优选100毫米。4.根据权利要求1所述的一种HPPH的纯化方法，其特征在于所述制备色谱法分离纯化采用的流动相为无机盐、极性有机溶剂与水组成的三元流动相，按体积比计算，所述极性有机溶剂:水＝40:60～99:1，优选为60:40～95:5。5.根据权利要求4所述的一种HPPH的纯化方法，其特征在于所述无机盐是指磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾、乙酸铵和甲酸铵中的一种，优选为磷酸氢二钾、甲酸铵和乙酸铵中的一种；所述无机盐在流动相中的浓度是1～50mmol/L，优选为5～20mmol/L。6.根据权利要求1所述的一种HPPH的纯化方法，其特征在于所述制备色谱法分离纯化采用的流动相为酸、极性有机溶剂与水组成的三元流动相，按体积比计算，所述极性有机溶剂:水＝40:60～99:1，优选为60:40～95:5。7.根据权利要求6所述的一种HPPH的纯化方法，其特征在于所述酸是指磷酸、甲酸、三氟乙酸和乙酸中的一种，优选为磷酸、甲酸和三氟乙酸中的一种；所述酸在流动相中的体积百分比为的0.01～1％，更优选为0.1％～0.5％。8.根据权利要求1所述的一种HPPH的纯化方法，其特征在于所述HPPH粗品，上样前，先加入极性有机溶剂溶解，然后再加入水，摇匀得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈贞亮，吕志卿，白骅，
申请(专利权)人：浙江海正药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33