从年长细胞群中富集和扩增高潜能人间充质干细胞制造技术

用于恢复间充质干细胞的再生能力以及从间充质干细胞的质量和/或数量降低的人(例如年长者)的骨髓基质细胞中分离和扩增缺陷较低的间充质干细胞的小亚群的方法、使用其的治疗和用于其的装置。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从年长细胞群中富集和扩增高潜能人间充质干细胞相关申请的交叉引用本申请要求2015年11月4日提交的美国临时申请No.62/250,664的权益，其内容通过引用并入本申请。关于联邦资助的研究或开发的声明本专利技术是在由美国退伍军人事务部(U.S.DepartmentofVeteransAffairs)授予的优异评审奖励计划(MeritReviewAwardProgram)(资助号1-01BX002145-01)的美国政府支持下进行的。政府对本专利技术享有一定的权利。
技术介绍
1.
本专利技术总体上涉及细胞生物学和医学领域。更特别地，本专利技术涉及用于恢复间充质干细胞的再生能力以及从骨髓来源间充质干细胞的数量和/或质量降低的人(例如年长者)的骨髓基质细胞中分离和扩增缺陷较低的间充质干细胞的亚群的方法、使用其的治疗和用于其的装置。2.相关技术描述由于现代医学已经消除早期生命死亡的许多原因，因此人预期寿命迅速增加。正因为如此，现在大多数人的寿命足够长以致于以比以往高得多的比率经历由年龄相关性退行性疾病引起的残疾。由于世界人口持续老龄化，这代表着重大的全球健康问题。基于间充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSC)的治疗对于治疗这些疾病具有巨大潜力。然而，间充质干细胞的数量和质量随着年龄而下降并且限制了干细胞治疗用于该老龄化群体的有效性和潜力。骨髓来源间充质干细胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcell，BM-MSC)能够自我更新并分化为多个细胞谱系。由于这些能力，BM-MSC在大多数组织类型的持续维持和修复中发挥重要作用。一般来说，MSC的数量和质量随着衰老而降低，这进而又与组织和器官功能的进行性衰竭有关。基于BM-MSC的治疗已经显示出治疗许多年龄相关性退行性疾病的巨大潜力。由于生物安全性问题和FDA规定，患者的自身(自体)干细胞被认为对基于细胞的治疗是优选的。此外，患者的年龄和疾病严重程度、提供BM-MSC的供体的年龄和健康以及用于分离和扩增BM-MSC的方法的差异可能会影响治疗结果。然而，BM-MSC的数量和质量随着衰老而降低，从而限制患者自身干细胞的治疗潜力。目前，许多干细胞储库公司(stemcellbankingcompany)要求客户提早捐赠，因为年长的干细胞丧失其潜能。因此，为了使这些治疗成功地用于许多患者，必须开发用于拯救衰老干细胞群的再生能力的策略。已经建议尽可能从衰老个体中分离出一些与年轻细胞相同的造血干细胞，尽管在群体水平下其潜能严重降低。(Cho，等，2008)。本专利技术人先前已经表明通过使衰老的鼠干细胞暴露于组织特异性基质能够拯救其再生潜能。(Chen，2010)。然而，对于人MSC尚未证实这一点。细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)是组织中细胞微环境(cellularniche)的重要组分，其提供启动或维持细胞功能的关键生物化学和物理信号(Chen，等，2007；Lai，等，2010)。组织特异性ECM微环境在体内和体外可能是提供化学和物理提示以指导/控制多能干细胞用于组织再生和修复所必需的(Chen，2010；Costa，等，2012)。随着组织工程的发展，多种支架生物材料已被开发以模拟ECM用于组织再生或修复(Nagaoka，等，2010)。其中，已用于支持祖细胞增殖和分化的材料包括壳聚糖、聚乙醇酸(PGA)、聚-(l)-乳酸(PLLA)、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLAG)和聚(乙二醇)-对苯二甲酸酯(PEFT/聚(对苯二甲酸丁二醇酯)(PBT))(Kagami，等，2008；Chan，等，2012；Chen，等，2005)。然而，这些聚合物支架可诱发由其降解产物的酸度引起的炎症(Athanasiou，等，1996；Cancedda，等，2003)。另一种潜在的支架材料Matrigel包含由EHS小鼠肉瘤细胞分泌的基底膜蛋白，并且已用于在培养中生长原代上皮细胞(Maria，等，2011)。虽然这种产品已取得不同程度的成功，但与复活骨髓基质细胞的长期目标不一致。天然支架材料(特别是丝)由于其宽范围的弹性(允许形成组织特异性支架)、孔尺寸(允许获取组织特异性营养和氧)、低细菌黏附、生物可降解性以及低毒性和免疫原性而是可期望的(Leal-Egana&Scheibel，2010)。最近，已报道，由骨髓(BM)细胞产生的天然细胞外基质(ECM)增强人和小鼠骨髓来源间充质干细胞(BM-MSC)的附着和增殖(Chen，等，2007；Lai，等，2010)。然而，仍然需要可用于从MSC的数量和质量降低的对象(例如年长对象)分离和/或产生能够细胞再生的MSC的方法、组合物和装置。此外，仍需要用于获得这些MSC以及将其施用于可能患有年龄相关性退行性疾病的需要干细胞治疗的对象的方法。专利技术概述有利的是，本专利技术人已开发了一种新方法，其允许从骨髓来源间充质干细胞的数量和/或质量降低的人(例如年长者)的骨髓基质细胞中分离和扩增临床上有价值的间充质干细胞(MSC)亚群。此外，本专利技术人已经公开了包含前述MSC的细胞培养系统和组合物。另外，本专利技术人已经开发了获得这些MSC的方法和将其施用于可患有年龄相关性退行性疾病和病症的需要干细胞治疗的对象的方法。此外，本专利技术人已开发了恢复骨髓基质细胞的再生能力的新方法。本文所述的方法、组合物和技术还可以应用于来源于除骨髓以外的来源例如脂肪组织、脐带血等的MSC。来自年长和年轻供体的MSC细胞的表型是不同的，但是存在重叠。本专利技术人在本文中公开了小尺寸骨髓来源间充质干细胞(BM-MSC)更可能表达早期干细胞的标志物，并且大细胞比小细胞更可能表达衰老标志物，例如活性氧类(reactiveoxygenspecies，ROS)的水平。本专利技术人在本文中描述了在从较年长供体分离的BM-MSC中发现的小细胞群，其尺寸与来自年轻供体的BM-MSC的尺寸相似。本专利技术人公开了来自较年长供体的小尺寸细胞可以在数个方面与年轻细胞更相似，包括增殖、分化、蛋白质表达和ROS谱。本专利技术人还公开了较年长对象中细胞的环境条件可以抑制较年长对象中细胞的增殖能力。本专利技术人在此公开了：为了改善从年长供体分离的BM-MSC的性能，可期望分离尺寸小并且还表达SSEA-4(SSEA+)的细胞。该群体在数个特性方面与来自年轻供体的细胞更紧密地相似，所述特性包括提高的增殖速率、提高的每细胞的三磷酸腺苷(ATP)含量、较高的端粒酶水平和较大的干细胞浓度。本专利技术人还公开了在ECM、尤其是来源于BM-MSC的ECM上培养细胞使得扩大SSEA-4阳性的小细胞之间的差异。本专利技术人还公开了SSEA-4阴性的小细胞当在ECM、尤其是来源于BM-MSC的ECM上培养时也显示显著恢复。因此，SSEA-4阳性群体和SSEA-4阴性群体二者均具有潜在的临床应用价值。在本专利技术的一方面，本文公开了向对象施用小尺寸骨髓来源间充质干细胞(BM-MSC)的方法，所述方法包括：(a)从第一供体收获第一BM-MSC组群，(b)根据尺寸和任选的SSEA-4表达来分选来自步骤(a)的BM-MSC，(c)分离小尺寸BM-MSC，(d)对小尺寸BM-MSC进行平板接种以进行培养，(e本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.向对象施用小尺寸骨髓来源间充质干细胞(BM‑MSC)的方法，所述方法包括：(a)从第一供体收获第一BM‑MSC组群，(b)根据尺寸和任选的SSEA‑4表达来分选来自步骤(a)的所述BM‑MSC，(c)分离所述小尺寸BM‑MSC，(d)将所述小尺寸BM‑MSC平板接种以进行培养，(e)扩增培养中的所述小尺寸BM‑MSC，(f)任选的储存来自步骤(e)的所述小尺寸BM‑MSC，以及(g)将来自步骤(e)和/或(f)的所述小尺寸BM‑MSC施用于所述对象。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.04 US 62/250,6641.向对象施用小尺寸骨髓来源间充质干细胞(BM-MSC)的方法，所述方法包括：(a)从第一供体收获第一BM-MSC组群，(b)根据尺寸和任选的SSEA-4表达来分选来自步骤(a)的所述BM-MSC，(c)分离所述小尺寸BM-MSC，(d)将所述小尺寸BM-MSC平板接种以进行培养，(e)扩增培养中的所述小尺寸BM-MSC，(f)任选的储存来自步骤(e)的所述小尺寸BM-MSC，以及(g)将来自步骤(e)和/或(f)的所述小尺寸BM-MSC施用于所述对象。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述对象与所述第一供体相同。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述小尺寸BM-MSC当在悬浮液中测量时具有小于30微米的中值直径。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述小尺寸BM-MSC在分离时表达SSEA-4(SSEA-4+)。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述对象为50岁或更年长。6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述对象为65岁或更年长。7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述对象为70岁或更年长。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中将所述小BM-MSC培养在TCP上或培养在来源于从第二供体获得的第二BM-MSC组群的细胞外基质(ECM)上。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第二供体为25岁或更年轻。10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述对象具有降低的BM-MSC数量和/或质量，和/或需要干细胞治疗。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述对象患有年龄相关性退行性疾病，和/或患有损害BM-MSC的数量或质量的疾病或病症，和/或已经或将接受损害BM-MSC的数量或质量的治疗。12.细胞培养系统，其包含培养基和分离自从第一供体获得的第一BM-MSC组群的分离的小尺寸BM-MSC，其中所述分离的小尺寸BM-MSC在分离时表达SSEA-4(SSEA-4+)，其中所述细胞培养系统不包含在分离时不是小尺寸的BM-MSC或在分离时不表达SSEA-4的BM-MSC，并且其中所述第一供体在提供所述第一BM-MSC组群时为65岁或更年长。13.根据权利要求12所述的细胞培养系统，其中所述分离的小尺寸BM-MSC当在悬浮液中测量时具有小于30微米的中值直径。14.根据权利要求12或13所述的细胞培养系统，其中所述细胞培养系统还包含来源于第二BM-MSC组群的细胞外基质(ECM)。15.根据权利要求14所述的细胞培养系统，其中所述第二BM-MSC组群从25岁或更年轻的第二供体获得。16.根据权利要求12至15中任一项所述的细胞培养系统，其中所述第一供体在提供所述第一BM-MSC组群时具有降低的BM-MSC数量和/或质量，和/或患有年龄相关性退行性疾病，和/或患有损害BM-MSC的数量或质量的疾病或病症。17.组合物，其包含分离自从第一供体获得的第一BM-MSC组群的分离的小尺寸BM-MSC，其中所述分离的小尺寸BM-MSC在分离时表达SSEA-4(SSEA-4+)，其中所述组合物不包含在分离时不是小尺寸的BM-MSC或在分离时不...

【专利技术属性】
技术研发人员：特拉维斯·布洛克，米洛斯·马林科维奇，陈晓东，
申请(专利权)人：德克萨斯大学系统董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US