用于亚细胞分析的纳米移液管装置和方法制造方法及图纸

本申请涉及用于亚细胞分析的纳米移液管装置和方法。描述了用于从活细胞提取细胞物质并且然后将其放置于纳升级的容器中的装置和方法。使用整合到扫描离子电导显微镜(SICM)中的纳米移液管，实现从人BJ成纤维细胞中提取线粒体DNA以及从HeLa/GFP细胞中提取绿色荧光蛋白(GFP)转录物，对细胞环境具有最小损伤并且在获得分离的样品之前没有化学处理。通过荧光显微术和提取的物质的PCR分析证实提取成功。所述方法和装置可被应用于许多不同的细胞类型和细胞内的靶，不仅允许在其天然状态下提取的物质的单细胞分析，还允许在其天然状态下提取的物质的单个亚细胞区室分析。

【技术实现步骤摘要】
用于亚细胞分析的纳米移液管装置和方法本申请是申请日为2014年03月13日，申请号为201480024866.4，专利技术名称为“用于亚细胞分析的纳米移液管装置和方法”的申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求2013年3月14日提交的美国临时专利申请号61/781,841的优先权，所述申请通过引用全文并入本文。政府支持的声明本专利技术根据国家健康研究所授予的合同HG000205和国家癌症研究所授予的合同U54CA143803在政府的支持下完成。政府在本专利技术中享有特定权利。对序列表、计算机程序或光盘的引用本申请包含序列表，所述序列表已作为ASCII文本文件提交，并通过引用全文并入本文。该文本文件在2014年2月18日创建，命名为“482_35_1_PCT_Seq_List.txt”，且大小为717字节。专利技术背景专利
本专利技术涉及用于单细胞的细胞内含物特别是线粒体DNA的提取的纳米装置领域。相关技术以下呈现了关于本专利技术的某些方面的背景信息，因为它们可能涉及在详述中被引用但不必然被详细描述的技术特征。即，本专利技术中使用的个别组合物或方法可在以下讨论的出版物和专利中被更为详细地描述，所述出版物和专利可为本领域技术人员提供进一步指导以制备或使用要求权利的本专利技术的某些方面。下文的讨论不应被理解为承认描述的专利或出版物的相关性或现有技术作用。人体中的生理和病理过程由动态微环境范围内的复杂的细胞-细胞相互作用控制。细胞生物分子分析传统上在一个克隆群体的细胞行为相同的假设下进行。该假设并非来源于实验证据，而是由于缺乏能够分析单个细胞的工具。此外，在单细胞水平上动态检测表型(即，基因表达、蛋白质活性、离子波动、信号传导)的能力是理解复杂环境中的细胞行为的关键(1-4)。1990年，JamesEberwine小组使用玻璃微量移液管分离了培养物中的单细胞，并证实了从所述细胞提取的RNA能够被扩增并分析(5)。该实验开创了单细胞生物学领域的先河，并且Eberwine小组成功地将该技术应用于理解神经元运作的分子基础(6)。在过去的20年中，生物分子分析随着高通量测序的发展而高速发展，所述高通量测序现在允许研究人员在单个读出(readout)中获得一个细胞中的活性基因的集群(collection)(7)。然而，单细胞的初始捕获仍然是主要技术问题(1)。自从Eberwine成功使用玻璃微量移液管以来，科学家们已经使用多种技术分离单细胞，所述多种技术从酶促消化(其从组织中释放细胞)到激光显微切割(其从组织切片中切出完整细胞的同质群体)。然而，这些方法并不能在细胞的天然环境中检查所述细胞，或同最初的微量移液管一样，它们被限制在探测分离的细胞上(8)。作为外科手术工具的纳米装置因为纳米级装置用于高空间和时间分辨率研究的潜力，它们是理想的单细胞外科手术工具(9-10)。目前两个小组独立地开发了用于单细胞分析的细胞纳米内窥镜。Singhal等人(11)将碳纳米管附接在玻璃微量移液管的最尖端，并显示其用于在低至单个细胞器的水平上探询(interrogate)细胞、转运液体以及进行光学和电化学诊断的潜力。SimilarlyYan等人(12)开发了附接至光学纤维的尖端的纳米线波导，其能够引导可见光进入活的哺乳动物细胞的细胞内区室中，并检测来自亚细胞区域的光学信号。圆筒形状的这些纳米内窥镜允许探测细胞内部深处的细胞器，但是这些技术缺乏任何自动操作能力；这些内窥镜被人工放置到细胞中，不允许进行需要大量样品分析的那些复杂生物问题的研究。这些纳米内窥镜与扫描探针技术的整合可克服该限制，有可能允许自动操作和高通量分析。2003年，Osada和同事将原子力显微镜(AFM)尖端插入活细胞中以提取mRNA(13)。用PCR技术分析所述mRNA以验证提取方案(14)。最近，Wickramasinghe小组通过用铂包被AFM尖端优化了该方法，这允许通过介电泳提取mRNA分子。Wichramasinghe的技术已经成功地与标准测定技术结合以检测乳腺癌细胞中的RNA分子(15-16)。操作并分析单细胞是理解控制细胞的功能和命运的过程的下一个新领域。随着高通量测序的引入，现在可能获得单细胞内部所有活性基因的集群，但是细胞遗传物质的初始捕获仍然是主要挑战。此外，目前用于单细胞操作的方法常常仅能够检测一类分析物。具体专利和出版物Seger等人,“Voltagecontrollednano-injectionsystemforsingle-cellsurgery,”Nanoscale4(19):5843-5846(2012)，公开了开发一种作为无标签感测平台的纳米移液管(20-24)和改造ICM以允许培养物中的单细胞的多成分注射(25)。Laforge等人,“Electrochemicalattosyringe，”ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences104(29):11895-11900(2007)，公开了一种基于玻璃纳米移液管的电化学阿注射器(attosyringe)，以通过电润湿作用将微量液体递送到活细胞中(26)。Mirkin等人,WO2008/054488,2008年5月8日公布,标题为“ElectrochemicalAttosyringeandItsUseasanElectrochemicalNanopumpDriver”，公开了一种填充有机溶剂的纳米移液管和驱动水性溶液的抽吸和递送的外部电压。Seger等人,US2012/0225435,2012年9月6日公布,本申请具有至少一个共同专利技术人并具有同一代理人,标题为“Nanopipetteapparatusformanipulatingcells”，公开了与xyz控制器和纳米移液管孔道中的电压差的电子控制元件相结合的纳米移液管，以高通量方式将物质电渗注射到细胞中并对细胞具有最小损害。该申请中未公开从细胞中提取物质和从纳米移液管中射出后分析所述物质，也未公开以天然的形式取出生物物质用于进一步分析。Seger等人,“Voltagecontrollednano-injectionsystemforsingle-cellsurgery”,Nanoscale4:19,2012年9月28日,第5843-6页，包含类似于上文引用的PG出版物的公开内容。Pavel等人,US20110131690,2011年6月2日公布,标题为“ScanningIonConductanceMicroscopy”，公开了扫描离子电导显微术及其在软表面和界面的研究中的用途，所述软表面和界面包括细胞和卷曲的基质结构的那些。如其中所公开的，扫描离子电导显微术(SICM)是扫描探针显微术(SPM)的一种形式，其允许无论如何都不会有任何接触或力相互作用的情况下并且在受试者的正常液体环境中对软表面进行高分辨率成像。专利技术概述以下的概述不预期包括本专利技术的全部特征和方面，其也不暗示本专利技术必须包括该概述中讨论的所有特征和方面。在某些方面，本专利技术涉及一种装置，所述装置包括纳米移液管，所述纳米移液管包括尖端；和第一电极，所述第一电极与纳米移液管的内部中的或邻近纳米移液管内部的第一电解质接触并被布置为与电流检测电路中的放大器本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于从单个细胞提取靶胞质内含物的方法，所述方法包括：(a)提供纳米移液管，所述纳米移液管具有xyz控制器、用于产生偏压的内部电极和外部电极，并且还具有纳米移液管，所述纳米移液管包含用于刺入单细胞的尖端；(b)操作所述纳米移液管装置，以引起纳米移液管吸入并从所述细胞提取靶胞质内含物，其中所述操作包括调整所述内部电极和所述外部电极之间的电压；(c)进一步调整电压，以防止所述提取的靶胞质内含物离开所述纳米移液管；(d)进一步调整所述电压，以引起所述提取的靶胞质内含物流出至样品容器中；(e)通过以下的一项或两项分析所述提取的靶胞质内含物：(i)分析来自所述提取的靶胞质内含物的mRNA；和(ii)分析来自所述提取的靶胞质内含物的一种或更多种选择的蛋白质。

【技术特征摘要】
2013.03.14 US 61/781,8411.一种用于从单个细胞提取靶胞质内含物的方法，所述方法包括：(a)提供纳米移液管，所述纳米移液管具有xyz控制器、用于产生偏压的内部电极和外部电极，并且还具有纳米移液管，所述纳米移液管包含用于刺入单细胞的尖端；(b)操作所述纳米移液管装置，以引起纳米移液管吸入并从所述细胞提取靶胞质内含物，其中所述操作包括调整所述内部电极和所述外部电极之间的电压；(c)进一步调整电压，以防止所述提取的靶胞质内含物离开所述纳米移液管；(d)进一步调整所述电压，以引起所述提取的靶胞质内含物流出至样品容器中；(e)通过以下的一项或两项分析所述提取的靶胞质内含物：(i)分析来自所述提取的靶胞质内含物的mRNA；和(ii)分析来自所述提取的靶胞质内含物的一种或更多种选择的蛋白质。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析mRNA包括分析来自所述细胞的...

【专利技术属性】
技术研发人员：保罗·阿克蒂斯，米歇尔·M·马卢夫，纳德·普曼德，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US