脑胶质瘤相关间充质干细胞参与肿瘤血管拟态的检测方法技术

本发明专利技术公开了脑胶质瘤相关间充质干细胞参与肿瘤血管拟态的检测方法。该方法包括以下步骤：（1）将gbMSCs进行诱导向血管周细胞分化；（2）将gbMSCs来源血管周细胞检测，包括免疫荧光法、流式细胞术、westen‑blot assay和血管生成试验；（3）将gbMSCs来源血管周细胞通过ELISA实验进行细胞因子检测；（4）将gbMSCs来源血管周细胞通过基因芯片技术进行miRNA修饰检测。通过对gbMSCs的分化诱导、周细胞检测、关键细胞因子检测、miRNA修饰检测以及细胞管结构形态的比对来确定脑胶质瘤相关间充质干细胞来源血管周细胞参与肿瘤血管拟态的作用，为胶质瘤的靶向治疗提供了有力的条件，同时也开发了细胞的更多生物特性。

【技术实现步骤摘要】
脑胶质瘤相关间充质干细胞参与肿瘤血管拟态的检测方法
本专利技术涉及细胞检测
，具体涉及脑胶质瘤相关间充质干细胞参与肿瘤血管拟态的检测方法。
技术介绍
脑胶质瘤是起源于脑部神经胶质细胞，是最常见的颅内肿瘤，约占所有颅内肿瘤的45%左右。在儿童恶性肿瘤中排第二位，近30年来，原发性恶性脑肿瘤发生率逐年递增，年增长率约为1.2%,中老年人群尤为明显。中国脑胶质瘤年发病率为3-6人/10万人，年死亡人数达3万人。脑胶质瘤在发生之初，通常没有典型的症状。随着肿瘤的不断增大，会表现出如下症状：一是颅内压增高和其他一般症状，如头痛、呕吐、视力减退、复视、癫痫发作和精神症状等。另一是脑组织受肿瘤的压迫、浸润、破坏所产生的局部症状，局部症状依肿瘤生长位置不同而异。胶质瘤系浸润性生长物，它和正常脑组织没有明显界限，难以完全切除，对放疗化疗不甚敏感，非常容易复发，生长在大脑等重要部位的良、恶性肿瘤，手术难以切除或根本不能手术。化学药物和一般抗肿瘤的中药，因血脑屏障等因素的影响，疗效也不理想，因此脑胶质瘤至今仍是全身肿瘤中预后最差的肿瘤之一。胶质瘤的生长和快速繁殖与其肿瘤微环境有着密切的联系，尤其是在肿瘤的生长过程中，肿瘤周围会出现大量的新血管系统，这些新血管的形成为肿瘤的快速增长提供着关键的生长环境和营养物质，所以控制新血管的形成是遏制肿瘤增长的有效办法，但是目前仍无法确定肿瘤新血管是由肿瘤微环境下何种细胞刺激分化而成，在肿瘤微环境下存在多种具有不同生物特性的细胞，所以对细胞生物特性的检测研究成为现代医学研究的方向，通过检测确定得到目标细胞，进而进行靶向控制或者治疗，以达到治疗效果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，针对上述现有技术的不足，提出脑胶质瘤相关间充质干细胞（glioma-associatedmesenchymalstemcells,gbMSCs）参与肿瘤血管拟态的检测方法，进而通过血管周细胞的诱导分化，通过多种方式联合检测确定周细胞分化，确定脑胶质瘤相关间充质干细胞参与肿瘤血管拟态。本专利技术提出脑胶质瘤相关间充质干细胞参与肿瘤血管拟态的检测方法，包括以下步骤：（1）将脑胶质瘤相关间充质干细胞进行血管周细胞诱导分化；（2）将脑胶质瘤相关间充质干细胞来源血管周细胞检测，包括免疫荧光法、流式细胞术、westen-blotassay和血管生成试验；（3）将脑胶质瘤相关间充质干细胞来源血管周细胞通过ELISA实验进行细胞因子检测；（4）将脑胶质瘤相关间充质干细胞来源血管周细胞通过基因芯片技术进行miRNA修饰检测。由于肿瘤环境中新血管的形成大部分为具有一定分化潜能的细胞分化而成，所以在体外对目标细胞进行诱导分化，确定其是否分化潜能，如具有分化潜能，即可进行进一步的检测研究。血管新生，是指新生毛细血管自成体血管出芽形成的复杂过程，包括内皮细胞的活化、迁移和增生。该过程对于正常生长发育、生殖、修复以及成血管性疾病(如关节炎、银屑病、血管瘤、糖尿病视网膜病)和肿瘤性疾病是必不可少的。血管新生是在一系列有着广泛相互作用的细胞和分子的共同调节下完成的。在血管出芽前，首先发生血管通透性增高和毛细血管基底膜的降解，随之趋化因子和丝裂原被激活以促进内皮细胞的迁移和增殖，最后是管状结构和基底膜的重建。基底膜的形成，标志着血管成熟的开始，主要是内皮细胞对周细胞的募集，从而形成有周细胞包绕的稳定的血管。具有中层的较大血管的形成还需要合适的信号以完成血管平滑肌细胞的募集。周细胞是调节血管形成、稳定和功能的关键因素。周细胞和内皮细胞间的相互作用在血管新生中具有极为重要的作用。所以，通过免疫荧光法、流式细胞术、westen-blotassay和血管生成试验来进行周细胞的定性和定量检测。免疫荧光法是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。该方法可对确定是否发生周细胞分化以及分化后的定量分析。westen-blotassay：固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。CD105，CD44，CD73和CD90为细胞膜糖蛋白，是调节TGF-β受体复合物的成分之一，调节细胞对TGF的反应，在血管生成的各种组织及肿瘤组织边缘部分血管起源的内皮细胞中高表达，是新生血管的标志，而新生血管的形成又是肿瘤生存的重要条件，所以对这些膜糖蛋白的检测，对确定细胞的生物特性是有着重要意义的。通过流式细胞术对其进行分析，不仅表达准确，而且具有较强的灵密度。血管形成试验是指通过对比培养进行管结构数量、管壁薄厚和长短情况的观察，以确定细胞具有维持和稳定血管结构的作用，同时也可作为周细胞定性的一个辅助判定。进一步的，所述脑胶质瘤相关间充质干细胞还要进行CCK8测试和划痕试验。CellCountingKit-8简称CCK8。可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8。它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazandye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。划痕试验是对细胞的迁移能力进行测试。因为细胞促进新血管的形成以及加强毛细血管结构还有一个重要的因素，那就是该细胞的增殖能力和迁移能力，增殖和迁移是分化血管形成和稳定血管结构的一个重要条件。CCK8和划痕试验的测试可以对更进一步的确定细胞的分化增殖的能力。miRNA修饰检测是通过基因技术来确定体外分化常规培养液和肿瘤条件培养液培养的血管周细胞miRNA的匹配和比对情况；体外分化后的细胞基因与体内成熟肿瘤血管细胞基因的比对，从基因的层面对周细胞分化加以证明；同时通过基因测序等技术可以确定基因被修饰的细胞，可以作为今后治疗研究的靶点。体外分化常规培养液和肿瘤条件培养液培养的血管周细胞miRNA进行比对进一步的，所述脑胶质瘤相关间充质干细胞采用的培养基为DMEM。DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在DMEM培养基的基础上研制的。与DMEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（低于4500mg/L）和低糖型(低于1000mg/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。进一步的，所述DMEM中包含胎牛血清、青霉素和链霉素。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24小时之内的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。加入双抗生素青霉素和链霉素是为了防本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.脑胶质瘤相关间充质干细胞参与肿瘤血管拟态的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）将脑胶质瘤相关间充质干细胞进行血管周细胞诱导分化；（2）将脑胶质瘤相关间充质干细胞来源血管周细胞检测，包括免疫荧光法、流式细胞术、westen‑blot assay和血管生成试验；（3）将脑胶质瘤相关间充质干细胞来源血管周细胞通过ELISA实验进行细胞因子检测；（4）将脑胶质瘤相关间充质干细胞来源血管周细胞通过基因芯片技术进行miRNA修饰检测。

【技术特征摘要】
1.脑胶质瘤相关间充质干细胞参与肿瘤血管拟态的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）将脑胶质瘤相关间充质干细胞进行血管周细胞诱导分化；（2）将脑胶质瘤相关间充质干细胞来源血管周细胞检测，包括免疫荧光法、流式细胞术、westen-blotassay和血管生成试验；（3）将脑胶质瘤相关间充质干细胞来源血管周细胞通过ELISA实验进行细胞因子检测；（4）将脑胶质瘤相关间充质干细胞来源血管周细胞通过基因芯片技术进行miRNA修饰检测。2.如权利要求1所述脑胶质瘤相关间充质干细胞参与肿瘤血管拟态的检测方法，其特征在于：所述脑胶质瘤相关间充质干细胞还要进行CCK8测试和划痕试验。3.如权利要求1所述脑胶质瘤相关间充质干细胞参与肿瘤血管拟态的检测方法，其特征在于：所述脑胶质瘤相关间充质干细胞采用的培养基为DMEM。4.如权利要求3所述脑胶质瘤相关间充质干细胞参与肿瘤血管拟态的检测方法，其特征在于：所述DMEM中包含胎牛血清、青霉素和链霉素。5.如权利要求1所述脑胶质瘤相关间充...

【专利技术属性】
技术研发人员：付朋，赵洪洋，易东晔，项炜，蔡晓立，张庆，薛冰洲，王羡科，王旋，熊南翔，姜晓兵，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42