一种遗传性骨病的分子诊断方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种遗传性骨病的分子诊断方法及试剂盒。所述的分子诊断方法是使用针对561个遗传性骨病相关基因的捕获探针，应用目标基因高通量平行靶向测序方法测定受试者相应基因的序列。所述的试剂盒包含针对561个遗传性骨病相关基因的捕获探针。本发明专利技术的方法具备高通量、高敏感性和特异性的优点，尤其可急剧降低遗传性骨病致病基因突变分析的费用，具有实际的临床意义，并有助于遗传性骨病基因突变谱的绘制和阐明遗传性骨病的分子致病机制，为遗传性骨病的早期精准诊断、精准治疗、产前诊断和遗传咨询等提供理论依据。

【技术实现步骤摘要】
一种遗传性骨病的分子诊断方法及试剂盒
本专利技术涉及疾病的分子诊断，具体地说，涉及一种遗传性骨病的分子诊断方法及试剂盒。
技术介绍
遗传性骨病是临床最为常见的出生缺陷之一，是一大类临床和遗传异质性较强的骨、软骨发育不良疾病，在我国前十大出生缺陷中就包括多指(趾)畸形(第2位)、马蹄内翻(第5位)、并指(趾)畸形(第7位)、肢体短缩(第9位)等遗传性骨病，严重影响患者生存质量，目前尚无有效的治疗方法。因此，对遗传性骨病遗传成因和分子机制的研究以及早期诊断、预防等的研究，对于降低我国出生缺陷率，提高遗传性骨病的诊治效率，具有重要的理论与实践意义。根据2015年“国际骨骼发育不良协会”最新版的评估标准，共有436种表型被纳入“遗传性骨病”，并按其分子遗传、生化以及影像学特点分为42组，已明确其中364个基因突变可导致遗传性骨病，但仍有约三分之一的遗传性骨病致病机制尚未明确。新的遗传性骨病相关致病基因的发现和鉴定是亟待解决的科学问题。由于遗传性骨病表型多样，涉及基因众多且复杂，导致遗传性骨病基因的异质性及每种综合征类型的遗传性骨病缺乏特异的临床表现、生化指标和影像学特征，导致临床上一直缺少一种对遗传性骨病进行明确诊断和分型的方法手段。建立可靠、有效的分子诊断方法，对提高临床遗传性骨病的确诊率、通过有效的临床遗传咨询和产前诊断进行遗传阻断、提高国民身体素质和人口质量具有重要的科学和社会意义。目前，临床实验室检测基因突变大多采用传统的Sanger测序法，而如果对遗传性骨病相关的众多基因同时检测，不仅工作量巨大，而且导致检测效率低，更重要的是浪费珍贵的DNA样本、明显增加基因诊断的检测成本，严重制约了其在临床分子诊断中的大规模应用。下一代测序(nextgenerationsequencing，NGS)也称高通量测序，与传统的Sanger测序技术相比具有高通量等优势。目标基因高通量平行靶向测序技术(targetsequencing)是一种利用序列捕获技术将候选的特定目标基因区域DNA进行捕捉并富集后进行靶向高通量测序的基因组分析方法，在最大限度地发挥下一代测序技术对疾病相关的已知致病基因作单管平行检测的同时，很大程度上又避免了全基因组测序和全外显子组测序产生的海量数据对下游生物信息学分析和解读造成的困难。而在实际的目标基因靶向测序技术中，还是需要克服探针制备、过程优化等众多关键环节的难题。在疾病的临床诊断上，对诊断方法的要求较高，必须具备高度的准确性、敏感性、特异性，且成本也是重要考虑因素之一。目前还未见具有实际临床应用意义的遗传性骨病诊断方法及相关试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种遗传性骨病的分子诊断方法、试剂及试剂盒。本专利技术第一方面提供了一种遗传性骨病的分子诊断方法，所述的分子诊断方法是使用针对561个遗传性骨病相关基因的捕获探针，应用目标基因高通量平行靶向测序方法测定受试者的所述561个遗传性骨病相关基因的序列。优选地，所述的561个遗传性骨病相关基因包括以下59个基因。HAND2GAS1RELACER1HOXD12OSR1BMP5PAPPA2PRRX1SOX4BMP3FGF18DKK1THBS1SFRP2SCXHOXA10RDH10COL27A1LECT1MEOX2LUMMEF2CCHADGLI1MATN1EGFRNR2F2SIX2PHOSPHO1CYTL1HMGA2RARGSATB2RUNX3AMELXHS6ST1TGFB3LTBP3FOXI1SOX11MMP14FRAS1DHRS3PDGFRAMMP16CRABP2TRIM45IRX5GJA5HOXA5GATA3FOXC2CHST11HOXA2ROBO1PRRX2RARBCITED2优选地，所述的捕获探针对目标区域的覆盖率达到99.4％以上。本专利技术另一方面提供了一种遗传性骨病的分子诊断试剂，其包含针对561个遗传性骨病相关基因的捕获探针。优选地，所述的561个遗传性骨病相关基因包括以下59个基因。本专利技术再一方面提供了一种遗传性骨病的分子诊断试剂盒，其包含如上任一所述的分子诊断试剂。本专利技术选择与遗传性骨病相关的561个候选基因，设计并构建针对这些基因所有外显子及侧翼序列的文库，通过对目标基因进行捕获，利用高通量的深度测序技术结合生物信息学分析，建立了遗传性骨病的高通量平行靶向测序基因诊断方法。本专利技术的方法具备以下优势：1、通过以课题组前期收集的50例各类遗传性骨病患者为研究对象，探讨了本方法的检测敏感性与特异性，结果敏感性和特异性均达95％以上；2、传统的Sanger测序费用为600元人民币/基因(上海标准)，如果本项目应用传统Sanger测序进行突变分析将要耗资600元×561基因＝336,600元人民币；而如果对50例遗传性骨病患者进行分析，单纯传统Sanger测序费用就达336,600元人民币×50＝16,830,000元人民币。相反，应用本专利技术的方法可急剧降低561个已知遗传性骨病致病基因突变分析的费用，可以降低到每位患者2500元。本专利技术的方法可应用于以下领域：1、基于本专利技术的方法，可开发相应的检测试剂盒，用于遗传性骨病的临床诊断；2、利用本专利技术的方法鉴定各类遗传性骨病患者的致病基因，初步分析各种遗传性骨病的基因突变谱，将为遗传性骨病的早期精准诊断、精准治疗、产前诊断和遗传咨询等提供理论依据；3、基于本专利技术的方法，进一步通过生物信息学分析等研究新的遗传性骨病相关基因变异的功能，初步阐明遗传性骨病的分子致病机制，绘制骨骼发育信号网络基因的构成并初步阐明其在骨骼发育中的功能，可以丰富发育生物学的知识和开展实验性治疗研究。附图说明图1.561个遗传性骨病相关目标基因捕获探针设计信息。图2.序列变异的生物信息学分析流程。图3.测序深度和覆盖度。图4.样本覆盖度。图5.样本Q20，Q30情况。图6.基因区域分布图。图7.功能分布图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。实施例1一、研究方法(1)遗传性骨病家系患者样本的收集本项目已采集50例遗传性骨病先证者及家系成员血样。(2)已知致病突变的临床遗传性骨病样本筛选(表1)表112例已知致病基因突变的遗传性骨病样本#诊断基因已知致病突变靶向高通量测序结果S01并指畸形GJA1c.302G>Tc.302G>TS02先天性马蹄内翻足FLNBc.4717G>Tc.4717G>TS03先天性挛缩畸形TNNI2c.533T>Gc.533T>GS04手指屈曲畸形FBN2c.3434G>Ac.3434G>AS05多指畸形GLI3c.714T>Ac.714T>AS06多并指畸形HOXD13c.556C>Tc.556C>TS07颅缝早闭FGFRL1c.506G>Ac.506G>AS8髋关节脱位BICD1c.1165G>Ac.1165G>A(3)遗传性骨病候选相关基因的遴选通过IPA通路分析、AmiGO2、LifeMapDiscovery等找寻参与本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种遗传性骨病的分子诊断方法，其特征在于，所述的分子诊断方法是使用针对561个遗传性骨病相关基因的捕获探针，应用目标基因高通量平行靶向测序方法测定受试者的所述561个遗传性骨病相关基因的序列。

【技术特征摘要】
1.一种遗传性骨病的分子诊断方法，其特征在于，所述的分子诊断方法是使用针对561个遗传性骨病相关基因的捕获探针，应用目标基因高通量平行靶向测序方法测定受试者的所述561个遗传性骨病相关基因的序列。2.根据权利要求1所述的分子诊断方法，其特征在于，所述的561个遗传性骨病相关基因包括以下59个基因。3.根据权利要求1所述的分子诊断方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：游国岭，傅启华，王志刚，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心，
类型：发明
国别省市：上海,31