一种检测组蛋白乙酰转移酶的电化学发光法拉第笼免疫传感器制造技术

本发明专利技术公开了一种检测组蛋白乙酰转移酶的电化学发光法拉第笼免疫传感器，特点是包括以下步骤：(1)制备捕获单元：合成磁性氧化石墨烯，依次用EDC/NHS溶液、HCl处理，随后与捕获抗体Ab1结合，常温孵育，最后加入BSA封闭GO表面的非特异性结合位点获得捕获单元Ab1‑nanoFe3O4@GO；(2)制备信号单元：识别抗体Ab2连接DNA四面体中，合成四面体‑Ab2；再合成纳米金(AuNPs)，使之与氧化石墨烯形成复合物GO@AuNPs，随后与四面体‑Ab2结合，再加入Ru发光体，制得信号单元；(3)制备法拉第笼免疫传感器：取Ab1‑nanoFe3O4@GO溶液滴涂于MGCE表面，得Ab1‑nanoFe3O4@GO/MGCE，记为电极a；取p300溶液滴涂于Ab1‑nanoFe3O4@GO/MGCE，得p300/Ab1‑nanoFe3O4@GO/MGCE，记为电极b；最后，取Ru‑GO@AuNPs‑四面体‑Ab2溶液滴涂于p300/Ab1‑nanoFe3O4@GO/MGCE，得Ru‑GO@AuNPs‑四面体‑Ab2/p300/Ab1‑nanoFe3O4@GO/MGCE，记为电极c，即为电化学发光法拉第笼免疫传感器。

An electrochemiluminescence Faraday cage immunosensor for detecting histone acetyltransferase

The invention discloses an electrochemiluminescent Faraday cage immunosensor for detecting histone acetyltransferase, which is characterized by the following steps: (1) preparing capture unit: synthesizing magnetic graphene oxide, then treating it with EDC/NHS solution and HCl, then combining with capture antibody Ab1, incubating at room temperature, and finally adding BSA to seal GO table. The capture unit Ab1_nanoFe3O4@GO was obtained at the nonspecific binding site of the surface; (2) signal unit was prepared: recognition antibody Ab2 was linked to DNA tetrahedron, and tetrahedron Ab2 was synthesized; then AuNPs was synthesized to form a complex GO_AuNPs with graphene oxide, then combined with tetrahedron_Ab2, and then added to Ru luminescent body. (3) Faraday cage immunosensor: Ab1 nanoFe3O4 @ GOsolution dropping on MGCEsurface, Ab1 820nanoFe3O4 @ GOsolution dropping on MGCEsurface, Ab1 820nanoFe3O4 @ GO / MGCE, recorded as electrode a; Ab1 820nanoFe3O4 @ GO / MGCEdropping on Ab1 820nanoFe3O4 @ GO / MGCE; P300 solution dropdropdropping on Ab1 820nanoFe3O4 @ GO / MGCE, p300 / Ab1 820nanoFeFe3 O4 @ GO / MGCE, recorded as electrode b; finally, Ru 820nanoFe3O4 @ AuNP @AuNP 820GO @ At p300/Ab1_nanoFe3O4@GO/MGCE, the tetrahedron Ru_GO@AuNPs_Ab2/p300/Ab1_nanoFe3O4@GO/MGCE was obtained and recorded as electrode c, i.e. electrochemiluminescent Faraday cage immunosensor.

【技术实现步骤摘要】
一种检测组蛋白乙酰转移酶的电化学发光法拉第笼免疫传感器
本专利技术涉及检测组蛋白乙酰转移酶的方法，尤其是涉及一种检测组蛋白乙酰转移酶的电化学发光法拉第笼免疫传感器的构建方法，属于功能材料和生物传感

技术介绍
组蛋白乙酰转移酶(HAT)是一种通过对核心组蛋白尾部赖氨酸残基进行可逆的乙酰化修饰进而调控转录的起始，由此介导基因激活和抑制的生物酶。组蛋白乙酰转移酶及其复合物参与了生物体内许多与基因转录调控相关的重要生理过程，如：DNA复制、修复，染色体组装以及细胞周期调控等。此外组蛋白乙酰化功能紊乱或乙酰转移酶的异常作用与肿瘤的形成特别是白血病的形成有关，代谢综合征和神经失调等也与乙酰化功能紊乱有紧密关系。在生物学及生理学上，HAT已经广泛用作药物标记。临床试验研究发现，乙酰化相关酶的量对恶性肿瘤细胞的发生发展有明显的抑制增殖或促进凋亡的作用，在癌症的发生发展及预后治疗中具有诱人的前景。总之，组蛋白乙酰化转移酶对恶性肿瘤的筛查、诊断、治疗和预防方面有着重要的指导意义。电化学发光(ECL)，是通过电极对含有化学发光物质的体系施加一定的电压或通过一定的电流，电极氧化还原产物之间或电极氧化还原产物与体系其它共存物质之间发生化学反应并生成某种不稳定的中间态物质，该物质分解而产生的化学发光现象，既集成了发光与电化学分析技术的优点，又具有二者结合产生的可控性、选择性、重现性好、灵敏度高、检测限低及动力学响应范围宽等新优势。电化学发光免疫传感器是一种将电化学发光技术与免疫学分析方法相结合而发展起来的具有高灵敏度、高选择性、低背景等特点的生物传感器。近代临床医学对疾病标志物免疫分子快速、灵敏的检测要求，极大的推动了信号放大型的电化学发光免疫传感器的研究。且随着生物技术和纳米材料技术的迅速发展，利用化学、材料及生物等多种技术特异性地转化并放大与免疫反应有关的检测信号，成为电化学发光免疫传感器的重要研究方向，利用电化学发光的高灵敏、高特异及操作简单等优势，构建免疫传感器成为当前研究的热点课题之一。早期检测乙酰化相关酶的方法主要是依赖于放射自显影技术或者放射性同位素标记技术，但这两种方法需要标记放射性元素，存在耗时费力、成本较高且对环境污染较大等缺点。近年来，研究者们试图寻找一些不需要标记放射性同位素的方法对乙酰化相关酶进行检测，以抗体识别和酶联免疫检测方法最为典型。目前，乙酰化相关酶活性研究只是“冰山一角”，且大部分工作存在一些不足之处，如仪器昂贵、操作复杂、技术要求高、步骤繁多、易出现假阳性和假阴性、特异性不强、灵敏度不高、响应时间长、无法重复测量等。因此，开发灵敏、准确、快速、简便的组蛋白乙酰转移酶检测方法是迫切需求。本专利技术构建了一种新型的“法拉第笼式”电化学发光免疫传感器，检测组蛋白乙酰转移酶(以HATp300为例)。该传感器构建过程中，使用捕获单元和信号单元。捕获单元的制备：由捕获抗体(Ab1)结合至磁性氧化石墨烯(nanoFe3O4@GO)表面得到Ab1-nanoFe3O4@GO，Ab1作为HATp300第一抗体，捕获HATp300。信号单元的制备：(1)通过氨基-羧基反应将HATp300第二抗体(Ab2)接入DNA四面体，记为四面体-Ab2；(2)合成氧化石墨烯(GO)和纳米金(AuNPs)的复合材料(GO@AuNPs)，通过金硫键作用将四面体-Ab2接到该复合材料表面，再嵌入带正电荷的发光体水合二氯三(1，10-邻二氮杂菲)钌(II)(Ru(phen)3Cl2·H2O，记为Ru)，得到信号单元Ru-GO@AuNPs-四面体-Ab2。在“法拉第笼式”传感器的构建过程中，大幅度提高了电化学发光体的标记数量，且使所有标记的电化学发光体都是有效的，都可参与电化学反应，产生电化学发光，极大地增强了检测灵敏度。目前国内外未见基于DNA纳米技术构建电化学发光法拉第笼免疫传感器，并用于检测组蛋白乙酰转移酶p300的相关报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、特异性强、组装过程简单以及检测速度快的一种检测组蛋白乙酰转移酶的电化学发光法拉第笼免疫传感器的构建方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种检测组蛋白乙酰转移酶的电化学发光法拉第笼免疫传感器，包括以下步骤：(1)捕获单元的制备a.铁离子混合溶液配制将0.4～1.2gFeCl3·6H2O及0.15～0.45gFeCl2·4H2O溶于25～75mL二次水中，混合均匀。现配现用。b.磁性氧化石墨烯(nanoFe3O4@GO)的合成取20～60mg氧化石墨烯(GO)于20～60mL二次水中，超声15～45min后，加入25～75mL上述铁离子混合溶液，快速搅拌，将上述混合溶液温度升至75～95℃，在快速搅拌回流状态下，逐滴加入20～30％氨水(NH4OH)至溶液pH为10，并反应30～60min，溶液颜色由棕色变为黑色，冷却至室温后，利用所得混合物的磁性，二次水反复清洗，直至上清液pH为中性，得到nanoFe3O4@GO溶液，用磷酸缓冲溶液(PBS，0.1M，pH7.4)定容至10～30mL，得浓度2mg/mLnanoFe3O4@GO的分散液。c.捕获单元(Ab1-nanoFe3O4@GO)的合成取25～75μL合成的nanoFe3O4@GO于200μL离心管中，加入25～75μL新制备的(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)溶液(100μM/10μM)，混合均匀后，滴加0.1MHCl至上述溶液pH为5.0；常温孵育0.5～1.5h，使GO表面形成稳定的活性酯层；基于磁性，用水快速洗涤直至上清液为中性；然后加入25～75μL0.5×10-3～1.5×10-3mg/mL组蛋白乙酰转移酶第一抗体(Ab1)溶液，混合均匀，常温孵育2～6h；最后加入25～75μL2wt％牛血清蛋白(BSA)，孵育0.5～1.5h，目的是封闭GO表面的非特异性结合位点；利用磁性，水洗三次，即可获得捕获单元Ab1-nanoFe3O4@GO。(2)信号单元的制备a.纳米金(AuNPs)的合成将氯金酸(HAuCl4)(0.005～0.015M，0.125～0.375mL)，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(0.05～0.15M，0.5～1.5mL)与水(7.05～10.05mL)混合，向反应混合物中加入抗坏血酸(0.05～0.15M，0.5～1.5mL)，然后加入氢氧化钠(0.05～0.15M，0.5～1.5mL)。将溶液震荡1～3min，静置1～3h。然后得到CTAB包覆的AuNPs，7000rpm离心10min，纯化后分散在10mL超纯水中。b.纳米金/氧化石墨烯复合材料(GO@AuNPs)的合成取2～6mgGO加入到0.5～1.5mL上述AuNPs溶液中，超声分散0.5～1.5h，得GO@AuNPs，随后静置15～45min备用。c.DNA四面体-第二抗体(DNA四面体-Ab2)的合成取修饰-NH2的DNA-A链(0.25～0.75μL，10～30μM)，加入组蛋白乙酰转移酶第二抗体溶液(Ab2)(0.5～1.5μL，0.5×10-2～1.5×10-2mg/mL)，同时加入pH为6.0的EDC/NHS偶联试剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测组蛋白乙酰转移酶的电化学发光法拉第笼免疫传感器，其特征在于该电化学发光免疫传感器通过以下方法构建的：首先，制备捕获单元：合成磁性氧化石墨烯nanoFe3O4@GO，依次用EDC/NHS溶液、HCl处理，随后与捕获抗体Ab1结合，混合均匀，常温孵育，最后加入BSA封闭GO表面的非特异性结合位点获得捕获单元Ab1‑nanoFe3O4@GO。其次，制备信号单元：识别抗体Ab2连接DNA四面体中，合成四面体‑Ab2；再合成纳米金(AuNPs)，使之与氧化石墨烯形成复合物GO@AuNPs，随后与四面体‑Ab2结合，再加入Ru发光体，制得信号单元。最后，制备法拉第笼免疫传感器：取Ab1‑nanoFe3O4@GO滴涂于MGCE表面，得Ab1‑nanoFe3O4@GO/MGCE，记为电极a；取p300溶液滴涂于Ab1‑nanoFe3O4@GO/MGCE，得p300/Ab1‑nanoFe3O4@GO/MGCE，记为电极b；再取Ru‑GO@AuNPs‑四面体‑Ab2溶液滴涂于p300/Ab1‑nanoFe3O4@GO/MGCE，得Ru‑GO@AuNPs‑四面体‑Ab2/p300/Ab1‑nanoFe3O4@GO/MGCE，记为电极c，即为电化学发光法拉第笼免疫传感器。...

【技术特征摘要】
1.一种检测组蛋白乙酰转移酶的电化学发光法拉第笼免疫传感器，其特征在于该电化学发光免疫传感器通过以下方法构建的：首先，制备捕获单元：合成磁性氧化石墨烯nanoFe3O4@GO，依次用EDC/NHS溶液、HCl处理，随后与捕获抗体Ab1结合，混合均匀，常温孵育，最后加入BSA封闭GO表面的非特异性结合位点获得捕获单元Ab1-nanoFe3O4@GO。其次，制备信号单元：识别抗体Ab2连接DNA四面体中，合成四面体-Ab2；再合成纳米金(AuNPs)，使之与氧化石墨烯形成复合物GO@AuNPs，随后与四面体-Ab2结合，再加入Ru发光体，制得信号单元。最后，制备法拉第笼免疫传感器：取Ab1-nanoFe3O4@GO滴涂于MGCE表面，得Ab1-nanoFe3O4@GO/MGCE，记为电极a；取p300溶液滴涂于Ab1-nanoFe3O4@GO/MGCE，得p300/Ab1-nanoFe3O4@GO/MGCE，记为电极b；再取Ru-GO@AuNPs-四面体-Ab2溶液滴涂于p300/Ab1-nanoFe3O4@GO/MGCE，得Ru-GO@AuNPs-四面体-Ab2/p300/Ab1-nanoFe3O4@GO/MGCE，记为电极c，即为电化学发光法拉第笼免疫传感器。2.如权利要求1所述的电化学发光法拉第笼免疫传感器，其特征是，制备氧化石墨烯nanoFe3O4@GO的具体方法是：取20～60mg氧化石墨烯(GO)于20～60mL二次水中，超声15～45min后，加入25～75mL上述铁离子混合溶液，快速搅拌，将上述混合溶液温度升至75～95℃，在快速搅拌回流状态下，逐滴加入20～30％氨水(NH4OH)至溶液pH为10，并反应30～60min，溶液颜色由棕色变为黑色，冷却至室温后，利用所得混合物的磁性，二次水反复清洗，直至上清液pH为中性，得到nanoFe3O4@GO溶液，用PBS(0.1M，pH7.4)定容至10～30mL，得浓度2mg/mLnanoFe3O4@GO的分散液。3.如权利要求1、2所述的电化学发光法拉第笼免疫传感器，其特征是，合成捕获单元(Ab1-nanoFe3O4@GO)的具体方法是：取25～75μL合成的nanoFe3O4@GO于200μL离心管中，加入25～75μL新制备的(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)溶液(100μM/10μM)，混合均匀后，滴加0.1MHCl至上述溶液pH为5.0；常温孵育0.5～1.5h，使GO表面形成稳定的活性酯层；基于磁性，用水快速洗涤直至上清液为中性；然后加入25～75μL0.5×10-3～1.5×10-3mg/mL组蛋白乙酰转移酶第一抗体(Ab1)溶液，混合均匀，常温孵育2～6h；最后加入25～75μL2wt％牛血清蛋白(BSA)，孵育0.5～1.5h，目的是封闭GO表面的非特异性结合位点；利用磁性，水洗三次，即可获得捕获单元Ab1-nanoFe3O4@GO。4.如权利要求1所述的电化学发光法拉第笼免疫传感器，其特征是，合成纳米金(AuNPs)的具体方法是：将氯金酸(HAuCl4)(0.005～0.015M，0.125～0.375mL)，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(0.05～0.15M，0.5～1.5mL)与水(7.05～10.05mL)混合，向反应混合物中加入抗坏血酸(0.05～0.15M，0.5～1.5mL)，然后加入氢氧化钠(0.05～0.15M，0....

【专利技术属性】
技术研发人员：胡宇芳，张青青，徐利华，王娇，饶家佳，郭智勇，王邃，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33