一种夜来香花叶病毒的TC-RT-nested-PCR检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种夜来香花叶病毒TC‑RT‑nested‑PCR检测试剂盒及其检测方法。本发明专利技术的夜来香花叶病毒检测试剂盒包括病毒抽提缓冲液、PBST缓冲液、外侧正向引物、外侧反向引物、内侧正向引物、内侧反向引物、RT Buffer、RNA酶抑制因子、反转录酶、dNTPs、PCR Mix、阳性对照和阴性对照。本发明专利技术根据夜来香花叶病毒外壳蛋白基因设计2对特异性引物，采用TC‑RT‑nested PCR技术对夜来香花叶病毒进行检测。本发明专利技术的检测方法无需RNA提取步骤，具有操作简便、成本低、特异性强、灵敏度高和准确性好的优点，适用于农业生产及进出境口岸上夜来香花叶病毒的快速检测和监测。

TC-RT-nested-PCR detection kit for night glory mosaic virus and its detection method

The invention discloses a test kit for detecting nocturnal mosaic virus TC_RT_nested_PCR and a test method thereof. The nocturnal mosaic virus detection kit comprises virus extraction buffer, PBST buffer, lateral forward primer, lateral reverse primer, medial forward primer, medial reverse primer, RT Buffer, RNA enzyme inhibitor, reverse transcriptase, dNTPs, PCR Mix, positive control and negative control. The invention designs 2 pairs of specific primers according to the capsid protein gene of the nocturnal mosaic virus, and detects the nocturnal mosaic virus by TC_RT_nested PCR technology. The detection method of the invention does not need RNA extraction steps, has the advantages of simple operation, low cost, strong specificity, high sensitivity and good accuracy, and is suitable for rapid detection and monitoring of nocturnal mosaic virus in agricultural production and at entry and exit ports.

【技术实现步骤摘要】
一种夜来香花叶病毒的TC-RT-nested-PCR检测试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及一种夜来香花叶病毒的TC-RT-nested-PCR检测试剂盒及其检测方法，属于植物检疫
，适用于农业生产及进出境口岸上夜来香花叶病毒的快速检测和监测。
技术介绍
西番莲(PassifloraeduliaSims)是西番莲科(Passifloraceae)西番莲属(passiflora)多年生草质藤本植物，原产南美的巴西、阿根廷，广泛分布于热带、亚热带地区，我国主要分布在台湾、广东、福建、广西、浙江、四川等地区。西番莲作为一种高级天然饮料作物，在栽培生产过程中，常常受到病虫害的危害，其中病毒病是西番莲生产上的第二大病害，严重影响西番莲的产量和品质，在巴西、澳大利亚、秘鲁、肯尼亚及我国台湾地区已成为限制西番莲生产发展的重要因素。迄今为止，国内外报道能够侵染西番莲的病毒主要包括西番莲病毒科(Potyviridae)西番莲Y病毒属(Potyvirus)、雀麦花叶病毒科(Bramovirida)黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)、双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)、芜菁黄花叶病毒科(Tymoviridae)芜菁黄花叶病毒属(Tymovirus)、柑橘粗糙病毒属(Cilevirus)、乙型线状病毒科(Betaflexiviridae)香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)、帚状病毒科(Virgaviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)、豇豆花叶病毒科(Comovirinae)线虫传多面体病毒属(Nepovirus)病毒等。其中，夜来香花叶病毒(Telosmamosaicvirus，TeMV)是近年来西番莲上新报道的一种马铃薯Y病毒属病毒，基因组具有典型的Potyvirus结构特征，正义ssRNA，全长9689nts，编码一个长的聚合蛋白。夜来香花叶病毒的病毒粒体呈线状，长约750nm，宽约12nm。夜来香花叶病毒侵染寄主植物主要引起花叶症状，在越南夜来香、泰国西番莲、印度尼西亚广霍香上已有发生危害的报道，该病毒可通过机械接种传播，但是否通过蚜虫传播尚未明确。由于西番莲在生产上常采用扦插、嫁接育苗，因此夜来香花叶病毒可能通过上述途径大面积或远距离传播。近年来，随着国内外对西番莲需求的不断增长，我国的西番莲种植面积逐渐增大，病毒病随之发生、传播和扩散的风险也越来越高。为预防与控制西番莲病毒病，加强病毒的早期检测，明确病毒发生的种类，对于及时制定有效的防治措施，保护西番莲生产安全具有重要意义。鉴别寄主鉴定、电子显微镜观察、血清学检测、RT-PCR是植物病毒检测诊断的常用方法。利用鉴别寄主鉴定方法需要隔离种植的指示植物，结果虽直观，但易受环境条件的影响；电子显微镜观察需要昂贵的仪器，并对操作的专业技术人员具有较高的要求；血清学酶联免疫吸附测定方法的灵敏度相对较低，检测结果容易出现假阴性。基于核酸水平的分子生物学方法检测植物病毒，具有特异性强、灵敏度高和时间快的显著优点，但该方法在夜来香花叶病毒上应用的研究报道极少。关于TC-RT-nestedPCR(试管捕捉巢式RT-PCR)技术检测夜来香花叶病毒，国内外至今尚未有报道，更未见专门用于夜来香花叶病毒检测的TC-RT-nestedPCR检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是如何快速、准确地检测农业生产及进出境口岸上的夜来香花叶病毒。为了解决上述技术问题，本专利技术克服了现有技术中存在的缺陷和不足，提供了一种夜来香花叶病毒的TC-RT-nestedPCR检测试剂盒及其检测方法，以满足农业生产及进出境口岸检疫的需要。第一方面，本专利技术保护用于检测或辅助检测夜来香花叶病毒的成套引物对。本专利技术提供的用于检测或辅助检测夜来香花叶病毒的成套引物对由特异引物对甲和特异引物对乙组成；所述特异引物对甲由外侧正向引物和外侧反向引物组成；所述特异引物对乙由内侧正向引物和内侧反向引物组成；所述外侧正向引物为如下a1)或a2)：a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；所述外侧反向引物为如下a3)或a4)：a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；所述内侧正向引物为如下b1)或b2)：b1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述内侧反向引物为如下b3)或b4)：b3)序列表中序列4所示的单链DNA分子；b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子。进一步的，所述外侧正向引物、所述外侧反向引物、所述内侧正向引物和所述内侧反向引物的摩尔比为1:1:1:1。第二方面，本专利技术保护上述成套引物对的新用途。本专利技术提供了上述成套引物对在如下c1)-c8)中任一所述的应用：c1)制备用于检测或辅助检测夜来香花叶病毒的产品；c2)检测或辅助检测夜来香花叶病毒；c3)制备用于鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为夜来香花叶病毒的产品；c4)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为夜来香花叶病毒；c5)制备用于检测或辅助检测待测样品是否感染夜来香花叶病毒的产品；c6)检测或辅助检测待测样品是否感染夜来香花叶病毒；c7)制备鉴别或辅助鉴别夜来香花叶病毒与其他病毒的产品；c8)鉴别或辅助鉴别夜来香花叶病毒与其他病毒。第三方面，本专利技术保护含有上述成套引物对的试剂盒；所述试剂盒的功能为如下d1)-d4)中任一种：d1)检测或辅助检测夜来香花叶病毒；d2)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为夜来香花叶病毒；d3)检测或辅助检测待测样品是否感染夜来香花叶病毒；d4)鉴别或辅助鉴别夜来香花叶病毒与其他病毒。进一步的，本专利技术的试剂盒包括含有夜来香花叶病毒的阳性对照样品和不含有夜来香花叶病毒的阴性对照样品。更进一步的，本专利技术的试剂盒由如下试剂组成：病毒抽提缓冲液(1×)、PBST缓冲液(1×)、外侧正向引物(10μmol/L)、外侧反向引物(10μmol/L)、内侧正向引物(10μmol/L)、内侧反向引物(10μmol/L)、RTBuffer(5×)、RNA酶抑制因子(40U/μL)、反转录酶(200U/μL)、dNTPs(10mmol/L)、PCRMix(2×)、含有夜来香花叶病毒的阳性对照样品、不含有夜来香花叶病毒的阴性对照样品和RNase-freeddH2O。上述试剂盒的制备方法也属于本专利技术的保护范围。所述试剂盒的制备方法为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：(Ⅰ)上述成套引物对中各引物对的各条引物分别单独包装；(Ⅱ)上述成套引物对中各引物对的各条引物按比例混合在一起。第四方面，本专利技术保护一种鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为夜来香花叶病毒的方法。本专利技术提供的鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为夜来香花叶病毒的方法包括如下步骤：e1)以待测病毒的cDNA为模板，采用上述特异引物对甲进行第1轮PCR扩增，得到第1轮PCR扩增产物；e2)以所述第1轮PCR扩增产本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测或辅助检测夜来香花叶病毒的成套引物对，由特异引物对甲和特异引物对乙组成；所述特异引物对甲由外侧正向引物和外侧反向引物组成；所述特异引物对乙由内侧正向引物和内侧反向引物组成；所述外侧正向引物为如下a1)或a2)：a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；所述外侧反向引物为如下a3)或a4)：a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；所述内侧正向引物为如下b1)或b2)：b1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述内侧反向引物为如下b3)或b4)：b3)序列表中序列4所示的单链DNA分子；b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子。

【技术特征摘要】
1.用于检测或辅助检测夜来香花叶病毒的成套引物对，由特异引物对甲和特异引物对乙组成；所述特异引物对甲由外侧正向引物和外侧反向引物组成；所述特异引物对乙由内侧正向引物和内侧反向引物组成；所述外侧正向引物为如下a1)或a2)：a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；所述外侧反向引物为如下a3)或a4)：a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；所述内侧正向引物为如下b1)或b2)：b1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述内侧反向引物为如下b3)或b4)：b3)序列表中序列4所示的单链DNA分子；b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子。2.如权利要求1所述的成套引物对，其特征在于：所述外侧正向引物、所述外侧反向引物、所述内侧正向引物和所述内侧反向引物的摩尔比为1:1:1:1。3.权利要求1或2所述的成套引物对在如下c1)-c8)中任一所述的应用：c1)制备用于检测或辅助检测夜来香花叶病毒的产品；c2)检测或辅助检测夜来香花叶病毒；c3)制备用于鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为夜来香花叶病毒的产品；c4)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为夜来香花叶病毒；c5)制备用于检测或辅助检测待测样品是否感染夜来香花叶病毒的产品；c6)检测或辅助检测待测样品是否感染夜来香花叶病毒；c7)制备鉴别或辅助鉴别夜来香花叶病毒与其他病毒的产品；c8)鉴别或辅助鉴别夜来香花叶病毒与其他病毒。4.含有权利要求1或2所述成套引物对的试剂盒；所述试剂盒的功能为如下d1)-d4)中任一种：d1)检测或辅助检测夜来香花叶病毒；d2)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为夜来香花叶病毒；d3)检测或辅助检测待测样品是否感染夜来香花叶病毒；d4)鉴别或辅助鉴别夜来香花叶病毒与其他病毒。5.权利要求4所述试剂盒的制备方法，为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：(Ⅰ)权利要求1或2所述的成套引物对中各引物对的各条引物分别单独包装；(Ⅱ)权利要求1或2所述的成套引物对中各引物对的各条引物按比例混合在一起。6.一种鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为夜来香花叶病毒的方法，包括如下步骤：e1)以待测病毒的cDNA为模板，采用权利要求1中所述的特异引物对甲进行第1轮PCR扩增，得到第1轮PCR扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢丽雪，李韬，张立杰，郑姗，张小艳，
申请(专利权)人：福建省农业科学院果树研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35