基于微流控芯片检测三种呼吸道病原体的试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术公开了一种基于微流控芯片的检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒以及使用方法，该试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的特异性保守序列的引物及TaqMan荧光探针。本发明专利技术的试剂盒采用的是微流控芯片技术，加样后所有操作都由仪器完成，操作简便，速度快，可在30～60min内完成检测，且不会造成污染；采用TaqMan探针荧光PCR技术，针对呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌进行检测，设计引物和探针的序列在呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的基因中都非常保守，特异性强，并能够在2小时内获得检测结果，灵敏度可达10copies/μL。

Detection kit for three kinds of respiratory pathogens based on microfluidic chip and its usage

The invention discloses a kit for detecting respiratory adenovirus, Streptococcus pneumoniae and pertussis Bacillus based on a microfluidic chip and a method for using the kit. The kit comprises a multiflux microfluidic nucleic acid detection chip with an active flow control circuit, a pre-packed dry powder detection reagent and a positive quality control product; and the pre-packed dry powder detection reagent. Primers and TaqMan fluorescent probes containing specific conserved sequences of respiratory adenovirus, Streptococcus pneumoniae and pertussis bacilli. The reagent kit of the invention adopts the microfluidic chip technology, after sampling, all operations are completed by the instrument, the operation is simple, the speed is fast, and the detection can be completed within 30-60 minutes without causing pollution; TaqMan probe fluorescent PCR technology is used to detect respiratory adenovirus, Streptococcus pneumoniae and pertussis bacillus. The primers and probes are highly conserved and specific in the genes of respiratory adenovirus, Streptococcus pneumoniae and pertussis bacillus. The sensitivity of the primers and probes can reach 10 copies/mu L within 2 hours.

【技术实现步骤摘要】
基于微流控芯片检测三种呼吸道病原体的试剂盒及其使用方法
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于微流控芯片的检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒及其使用方法。
技术介绍
呼吸道腺病毒(RespiratoryAdenovirus,ADV)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae,SP)和百日咳杆菌(Bordetellapertussis,BP)是造成儿童呼吸道疾病的常见病原体，对婴幼儿健康造成很大的威胁，ADV、SP和BP感染已成为全球性的问题。分子诊断技术可以满足对ADV、SP和BP快速诊断的需求，并且由于它们的遗传物质都为脱氧核糖核酸，样本提取后不需要进行逆转录过程，可以直接进行分子检测，所以能够快速、准确地进行病原体筛选，从而配合以正确的治疗，减少抗菌药物的滥用。呼吸道腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，已知的有68种，分为A、B、C、D、E、F和G七个亚群，会引起呼吸道感染的主要为B组的3型、4型和7型。可以引起多种临床疾病，如感冒、支气管炎和肺炎，还可以导致急性发热性咽喉炎、咽结膜炎等疾病，5岁及以下儿童为易感人群。呼吸道腺病毒感染起病缓慢，首先表现为发热、咳嗽等，高热(39～41℃)持续8～14天，起病后3～4天出现呼吸困难，肺部体征出现较晚，可见肺外病症如肾病、肝肿大等。呼吸道腺病毒感染可能会很严重，尤其对免疫力低下的病人，会出现呼吸衰竭、传播性感染、出血性膀胱炎、神经性疾病，甚至死亡。呼吸道腺病毒常经空气飞沫传播，密切接触(手-鼻)传播等。多发生在冬末、春初，在婴幼儿、家庭、医院及新兵等群体中常可引起流行。肺炎链球菌是革兰氏阳性菌，菌体似矛头状，成双或成短链状排列，5％～10％正常人上呼吸道中携带此菌，一般不致病；有毒株其致病性，与荚膜有密切关系，尤其在呼吸道病毒感染后或婴幼儿、年老体弱者易发生肺部感染。肺炎链球菌可引起大叶性肺炎、脑膜炎、支气管炎等疾病，也是鼻窦炎、急性细菌性中耳炎和超过幼儿期的结膜炎的最常见原因。典型的大叶性肺炎起病急骤，病人有高烧、寒颤，开始时有阵发性干咳，不久有少量粘液痰，随后痰变黄色，呈粘脓性。据WHO估计，肺炎链球菌性疾病已经成为5岁以下儿童中疫苗可预防性疾病的首位致死因素，每年死于肺炎链球菌感染的人中5岁以下儿童占一半，甚至更多，发展中国家发生率与死亡率更高。百日咳杆菌为革兰氏阴性菌，是小儿常见的急性呼吸道传染病，也能够感染青少年和成人。百日咳的特征为阵发性痉挛性咳嗽，咳嗽末伴有特殊的吸气吼声，病程较长，可达数周甚至3个月左右，故有百日咳之称。病人，尤其是症状轻微的非典型病人是重要的传染源，主要经飞沫传播。易感儿童接触病人后发病率接近90％，一岁以下患儿病死率高。百日咳潜伏期1～2周，发病早期(卡他期)仅有轻度咳嗽。细菌此时在气管和支气管粘膜上大量繁殖并随飞沫排出，传染性最大。1～2周后出现阵发性痉挛性咳嗽(痉挛期)，这时细菌释放毒素，导致粘膜上皮细胞纤毛运动失调，大量粘稠分泌物不能排出，刺激粘膜中的感受器产生强烈痉咳，呈现出特殊的高音调鸡鸣样吼声。形成的粘液栓子还能堵塞小支气管导致肺不张和呼吸困难、紫绀，此外可伴有呕吐、惊厥。4～6周后逐渐转入恢复期，阵咳减轻，趋向痊愈，但有1～10％病人易继发溶血性链球菌、流感杆菌等的感染。现有技术针对呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的检测方法主要有分离培养法、免疫检测法、普通聚合酶链式反应(PCR)技术和荧光PCR法。培养法是把病原体在特定培养基上进行培养，再对产生的结果进行观察分析，例如从血液或胸腔积液培养分离获得肺炎链球菌仍是作为诊断的金标准。免疫法是通过抗原抗体发生特异性结合来检测目的蛋白。PCR法是核酸体外扩增技术，利用引物将待测目标基因在短时间内通过酶促化学反应扩增几十万甚至上百万倍。荧光PCR法是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时监测，定性或定量检测目的基因。呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌感染已成为全球性的问题，对儿童健康造成很大的威胁，世界范围内对这三种病原体快速检测的需求也越来越高，而市场上的产品却少之又少，且暂无已注册的利用荧光PCR法进行检测的产品。微流控芯片(microfluidics)或称芯片实验室(Lab-on-a-Chip)是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备，生物与化学反应，分离、检测等基本操作单元或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。这种技术原则上适用于从核酸、蛋白质直到有机、无机小分子的各种不同类型分子的反应、分离和检测。微流控芯片具有液体流动可控、消耗试样和试剂极少、分析速度成十倍上百倍地提高等特点，它可以在几分钟甚至更短的时间内进行上百个样品的同时分析,并且可以在线实现样品的预处理及分析全过程。目前利用荧光定量PCR法检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒市面上暂无已注册的同类产品，对这三种病原体的单项检测类产品也十分少，且全部为免疫检测法。但肺炎链球菌和百日咳杆菌有利用荧光PCR法检测的专利技术专利，其组成一般包括盐离子缓冲液、酶、引物、探针、质控品，以液态形式分管保存在-20℃下，使用时需要将多管试剂融化，按照一定的比例进行混合，配制成检测反应液，然后加入样本核酸，放入荧光定量PCR仪中进行检测，最后根据扩增曲线分析检测结果。免疫法检测试剂针对的是样本中病原体引起机体产生的特异性抗体，抗体的检测有窗口期，在发病初期容易漏诊，且灵敏度、特异性较低，样本易污染且干扰物质较多，浓度过高或者过低时都容易造成结果错判，需要重复检测、复查才能确诊，检测的可信度较差；采用培养法检测耗时一般在一天以上，培养效果差，很多病原体无法培养，延误最佳治疗时机。普通的荧光PCR检测试剂虽然具有较好的灵敏度和特异性，但是试剂盒一般为多管液态试剂构成，平时需要保存在-20℃环境中，在操作时需要将各管试剂按照比例混合使用，对于保存运输条件、操作方法等方面有较高的要求，容易因保存不当和操作失误引起检测结果不可信。同时由于甲型流感病毒和乙型流感病毒的亚型种类很多，检测试剂盒一般针对的是甲型流感病毒和乙型流感病毒最为常见的亚型，有时因为病毒毒株的变异，可能会产生漏检的情况。由于荧光定量PCR仪检测后的结果需要专业人员来对扩增曲线分析，有时候会有人为误差产生。最后，因为荧光定量PCR仪的升降速度较慢，检测时间一般在1～2个小时，耗时较长。为了对呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌进行快速准确检测，且能在各种环境中简便易用，需要一种基于微流控芯片的检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒及其使用方法，并且要保证检测的时效性、特异性和灵敏度。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，提供一种可同时快速检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌三种病原体的基于微流控芯片的检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是，该基于微流控芯片的检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于微流控芯片的检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的特异性保守序列的引物及TaqMan荧光探针；其中，特异性保守序列的引物序列为：呼吸道腺病毒，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；肺炎链球菌，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；百日咳杆菌，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；特异性TaqMan探针序列为：呼吸道腺病毒，SEQ ID NO.3；肺炎链球菌，SEQ ID NO.6；百日咳杆菌，SEQ ID NO.9。

【技术特征摘要】
1.一种基于微流控芯片的检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的特异性保守序列的引物及TaqMan荧光探针；其中，特异性保守序列的引物序列为：呼吸道腺病毒，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；肺炎链球菌，SEQIDNO.4和SEQIDNO.5；百日咳杆菌，SEQIDNO.7和SEQIDNO.8；特异性TaqMan探针序列为：呼吸道腺病毒，SEQIDNO.3；肺炎链球菌，SEQIDNO.6；百日咳杆菌，SEQIDNO.9。2.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒，其特征在于，所述预装干粉检测试剂还包括有PCR缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白、dATP、dUTP、dCTP、dGTP，MgCl2、HotStartTaq酶、逆转录酶、UNG酶。3.根据权利要求2所述的基于微流控芯片的检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒，其特征在于，所述引物在扩增体系中的终浓度为100～1000nM；所述探针在扩增体系中的终浓度为50～500nM；所述海藻糖在扩增体系中的终浓度为1％～10％w/v；所述牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度为0.1％～5％w/v；所述HotStartTaq酶、逆转录酶、UNG酶在扩增体系中的终浓度为0.5U～5U；所述dATP、dUTP、dCTP、dGTP在扩增体系中的终浓度均为0.1mM～2mM；所述MgCl2在扩增体系中的终浓度为1.5mM～10mM。4.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品中含有呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的扩增基因序列的质粒。5.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：许行尚，杰弗瑞·陈，王龙，于沛，张蓉蓉，
申请(专利权)人：南京岚煜生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32