一种检测细菌AmpC基因的引物组、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及微生物检测领域，具体而言，涉及一种检测细菌AmpC基因的引物组、试剂盒及检测方法。所述引物组至少包含两种AmpC基因ACC,FOX,MOX,CIT,DHA和EBC的引物，结合多重PCR技术，解决现有技术中AmpC基因型检测不足的问题，检测范围广、特异性高，能简便、快速检测细菌AmpC基因。

Primer group, reagent kit and detection method for detecting bacterial AmpC gene

The invention relates to the field of microbial detection, in particular to a primer group, a kit and a detection method for detecting bacterial AmpC gene. The primers group contains at least two kinds of primers of AmpC gene ACC, FOX, MOX, CIT, DHA and EBC, and combines with multiplex PCR technology to solve the problem of insufficient AmpC genotype detection in the existing technology. The detection range is wide, the specificity is high, and the AmpC gene of bacteria can be easily and quickly detected.

【技术实现步骤摘要】
一种检测细菌AmpC基因的引物组、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及病原微生物检测领域，具体而言，涉及一种检测细菌AmpC基因的引物组、试剂盒及检测方法。
技术介绍
AmpC酶存在于大多数革兰氏阴性杆菌中，是导致革兰氏阴性杆菌对广谱β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制。按传播的介导方式可以分为质粒介导传播和染色体介导传播两种。质粒介导AmpC酶危害严重，这是因为一种质粒可同时携带多个耐药基因，使得产AmpC酶的菌株表现出多重耐药性，而且耐药谱呈现扩大趋势。另一方面，质粒的可传递性，不仅可发生在同菌种之间，还可以发生在不同菌种之间，从而导致耐药菌株更为广泛传播，严重了阻碍了临床治疗。从1989年Bauerfeind等报道质粒介导AmpC酶(CMY-1)以来，很多质粒AmpC酶在世界各地陆续被报道，目前已发现的多达两百多种。对报道的质粒AmpC基因进行DNA序列分析，并与某些种属的染色体AmpC基因进行同源性比较，可将质粒介导AmpC基因分为6个群：ACC,FOX,MOX,DHA,CIT和EBC。至今，美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)还没有推荐检测AmpC酶的标准方法，如何快速、准确的检测质粒介导AmpC酶是临床实验室面临的一个普遍难题。Perez-Perez等根据AmpC基因的同源性，针对6群设计了6组特异性引物，多重PCR几乎能扩增出所有的质粒AmpC基因，并通过测序确定基因型和发现新基因型。该多重PCR方法随后被很多研究采纳，近乎作为一种“金标准”被广泛用于质粒AmpC基因型别的检测。但该方法只覆盖了当时发现的29种基因型，对于后来新发现的众多基因型，该方法则无法检出。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种检测细菌AmpC基因的引物组，所述引物组至少包含两种AmpC基因ACC,FOX,MOX,CIT,DHA和EBC的引物，结合多重PCR技术，解决现有技术中AmpC基因型检测不足的问题，检测范围广、特异性高，能简便、快速检测细菌AmpC基因。本专利技术的第二目的在于提供一种检测细菌AmpC基因的试剂盒，其包括如上所述的引物组和辅助检测试剂，具有包装良好、使用方便的优点。本专利技术的第三目的在于提供一种非诊断目的的细菌AmpC基因的检测方法，其使用所述引物组或试剂盒对待检测细菌样本的总DNA或质粒DNA进行扩增，通过检测扩增产物中AmpC基因是否存在以确定所述检测细菌样本的AmpC酶，能够对细菌中的多种AmpC基因同时进行检测，该方法检测范围广、特异性好、灵敏度高，适合大规模样本检测中推广应用。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种检测细菌AmpC基因的引物组，所述引物组选自下列引物对中的至少两种；一种检测细菌AmpC基因的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组和辅助检测试剂。利用上述的引物组或试剂盒进行非诊断目的的细菌AmpC基因检测的方法，包括：使用所述引物组或试剂盒对待检测细菌样本的总DNA或质粒DNA进行扩增，通过检测扩增产物中AmpC基因是否存在以确定所述检测细菌样本的AmpC酶。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术针对近来发现的且目前已报道的AmpC基因设计6组特异性扩增引物可以有效地扩增ACC,FOX,MOX,DHA,CIT和EBC型，从而建立起一种简便、快速检测细菌AmpC基因的方法。(2)本专利技术能够更加方便快速地从临床细菌标本中检测AmpC基因型(ACC,FOX,MOX,CIT,DHA和EBC)，通过6对特异性引物和一个PCR反应即可得到全部基因型结果，并且与单一基因PCR结果相比，准确率、特异性和灵敏性可达100％，因此提高了检测效果和准确性。检测范围广、特异性好、灵敏度高，适合大规模样本检测中推广应用。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为一个实施方式中的AmpC基因型ACC,FOX,MOX,CIT,DHA和EBC多重PCR电泳结果图，其中1和6是空白对照，2～5为ACC,FOX,MOX,CIT,DHA和EBC多重基因PCR扩增结果；图2为一个实施方式中的含AmpC基因CMY-2和DHA的临床分离株和不含AmpC酶耐药基因的临床分离株的多重PCR电泳结果图，其中1为阴性对照，2和3为CMY-2基因PCR扩增结果，4和5为DHA基因PCR扩增结果，6～8为不含AmpC基因的临床分离株DNAPCR扩增结果；图3为一个实施方式中的构建好的含有细菌AmpC基因ACC,FOX,MOX,CIT,DHA和EBC全长pUC57质粒的不同稀释倍数的多重PCR电泳结果图，其中1为阴性对照，2～11为含有细菌AmpC酶耐药基因ACC,FOX,MOX,CIT,DHA和EBC的pUC57质粒混合物，浓度依次为2和3为1.0×106拷贝/μL、4和5为1.0×105拷贝/μL、6和7为1.0×104拷贝/μL、8和9为1.0×103拷贝/μL、10和11为1.0×102拷贝/μL。具体实施方式一种检测细菌AmpC基因的引物组，所述引物组选自下列引物对中的至少两种；本专利技术针对新发现的且目前已报道的AmpC基因设计6组特异性扩增引物可以有效地扩增ACC,FOX,MOX,DHA,CIT和EBC型，从而建立起一种简便、快速检测细菌AmpC基因的方法。所述引物组可以根据本领域的现有技术合成，也可以委托专业的公司制备。引物组可以将SEQIDNO：1-12所示的核苷酸分别储存于不同的容器，例如EP管中，也可以将每对引物对中的正向引物和反向引物混合存放。一种检测细菌AmpC基因的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组和辅助检测试剂。在一些实施方式中，所述辅助检测试剂包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸混合物、DNA聚合酶、水、阳性对照、阴性对照和DNA分子量内标中的一种或多种。在一些实施方式中，所述PCR缓冲液的主要成分包括Tris-HCl、KCl和MgCl2的一种或多种。PCR缓冲液可为10×PCR缓冲液，10×PCR缓冲液包括100mMTris-HCl(pH8.3)，500mMKCl，15mMMgCl2的一种或多种。优选地，脱氧核糖核苷三磷酸混合物中dGTP、dCTP、dATP、dTTP的浓度均为25mM，在PCR反应体系中dGTP、dCTP、dATP、dTTP的最终浓度均为0.2mM。在一些实施方式中，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶、Klenow片段。优选地，所述DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶。TaqDNA聚合酶的浓度为5U/μL,在PCR反应体系中TaqDNA聚合酶的最终浓度为0.025U/μL。在一些实施方式中，所述阳性对照为含有所述细菌AmpC基因CIT、ACC、FOX、MOX、DHA和EBC全长的一种或多种的pUC57质粒。阳性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测细菌AmpC基因的引物组，其特征在于，所述引物组选自下列引物对中的至少两种；

【技术特征摘要】
1.一种检测细菌AmpC基因的引物组，其特征在于，所述引物组选自下列引物对中的至少两种；2.一种检测细菌AmpC基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组和辅助检测试剂。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述辅助检测试剂包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸混合物、DNA聚合酶、水、阳性对照、阴性对照和DNA分子量内标中的一种或多种。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液的主要成分包括Tris-HCl、KCl和MgCl2的一种或多种。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶、Klenow片段。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶。7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有所述基因CIT、AC...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐梦君，高玉时，周生，张小燕，周倩，张静，唐修君，蒲俊华，陆俊贤，刘茵茵，
申请(专利权)人：江苏省家禽科学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32