引物组合、探针、试剂盒以及碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种引物组合，包括正向引物和反向引物，用于扩增碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM中如SEQ ID NO.1所示的序列。本发明专利技术还公开了一种探针，所述探针包括寡核苷酸序列、与所述寡核苷酸序列的5’端连接的荧光基团以及与所述寡核苷酸序列的3’端连接的淬灭基团，所述寡核苷酸序列能够与SEQ ID NO.1所示序列配对。本发明专利技术还公开了一种试剂盒，包括用于检测碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM中SEQ ID NO.1所示序列的检测试剂。本发明专利技术还公开了一种碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM的检测方法。

Detection methods of primer combination, probe, kit and carbapenem antibiotic resistance gene blaVIM

The present invention discloses a combination of primers, including forward and reverse primers, for amplifying the sequence of carbapenem antibiotic resistance gene blaVIM as shown in SEQ ID NO.1. The invention also discloses a probe comprising an oligonucleotide sequence, a fluorescent group connected to the 5'end of the oligonucleotide sequence, and a quenched group connected to the 3' end of the oligonucleotide sequence, which can be paired with the sequence shown in SEQ ID NO.1. The invention also discloses a reagent kit comprising a detection agent for detecting the SEQ ID NO.1 sequence in the carbapenem antimicrobial resistance gene blaVIM. The invention also discloses a detection method for carbapenem antibiotic resistance gene blaVIM.

【技术实现步骤摘要】
引物组合、探针、试剂盒以及碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM的检测方法
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种引物组合、探针、试剂盒以及碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM的检测方法。
技术介绍
自1928年发现青霉素至今90年里，抗菌药物在人类生产、生活中的滥用和不合理应用导致细菌耐药问题愈演愈烈，多耐药、泛耐药、全耐药菌株日益增多，为全球公共卫生带来严峻挑战。细菌耐药的遗传机制包括固有耐药性和获得耐药性。固有耐药性是指细菌对某些抗菌药物天然不敏感；获得耐药性是由于细菌的基因发生改变从而导致其获得了耐药性。细菌获得耐药性通常有以下两种途径：一种是细菌染色体基因突变获得耐药性；另一种是从环境或者其他细菌中获得的可移动耐药基因元件。目前无论在人医、兽医、环境耐药性等领域，由耐药基因元件播散导致的获得性耐药受到广泛关注，细菌可通过多种方式从外界获得可移动耐药基因元件，如通过噬菌体介导的转导、耐药质粒接合转移、转座子和转化等。blaVIM是一类位于可转移质粒上的碳青霉烯类抗菌药物耐药基因，携带该基因的细菌获得产碳青霉烯酶能力从而对该类抗菌药物耐受。细菌耐药基因元件的基因型检测是细菌耐药性检测和监测的一种方法。由于耐药基因的基因型存在多种亚型，目前的检测方法只能针对某一特定的亚型进行检测，缺乏普适性的方法用于检测多种亚型。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种引物组合、一种探针、一种试剂盒以及一种碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM的检测方法，实现对耐药基因blaVIM的多种亚型的检测。一种引物组合，包括正向引物和反向引物，用于扩增碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM中如SEQIDNO.1所示的序列。在其中一个实施例中，所述正向引物的序列如SEQIDNO.2所示，所述反向引物的序列如SEQIDNO.3所示。在其中一个实施例中，所述碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM包括blaVIM-1、blaVIM-2、blaVIM-3、blaVIM-4、blaVIM-5、blaVIM-6、blaVIM-8、blaVIM-9、blaVIM-10、blaVIM-11、blaVIM-12、blaVIM-14、blaVIM-15、blaVIM-16、blaVIM-17、blaVIM-18、blaVIM-19、blaVIM-23、blaVIM-24、blaVIM-25、blaVIM-26、blaVIM-27、blaVIM-28、blaVIM-29、blaVIM-30、blaVIM-31、blaVIM-32、blaVIM-33、blaVIM-34、blaVIM-35、blaVIM-36、blaVIM-37、blaVIM-38、blaVIM-39、blaVIM-42、blaVIM-43、blaVIM-44、blaVIM-45和blaVIM-46中的一种或多种。一种探针，所述探针包括寡核苷酸序列、与所述寡核苷酸序列的5’端连接的荧光基团以及与所述寡核苷酸序列的3’端连接的淬灭基团，所述寡核苷酸序列能够与SEQIDNO.1所示序列配对。在其中一个实施例中，所述寡核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。一种试剂盒，包括用于检测碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM中SEQIDNO.1所示序列的检测试剂。在其中一个实施例中，所述检测试剂包括所述的引物组合。在其中一个实施例中，所述检测试剂还包括所述的探针。一种碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM的检测方法，包括以下步骤：取预定量的待测样本，提取总DNA；以及以所述总DNA为模板，以所述的引物组合进行PCR扩增；以及测定扩增产物的序列长度。一种碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM的检测方法，包括以下步骤：S10，提供所述的引物组合和所述的探针，以含有SEQIDNO.1所示序列的标准品为模板，对含有不同浓度的所述标准品的多个标准品溶液进行实时荧光定量PCR反应，得到实时荧光定量PCR反应的标准曲线；以及S20，以待测样本为模板，采用与所述步骤S10相同的引物组合、探针及反应条件进行实时荧光定量PCR反应，将得到的Ct值代入所述标准曲线，得到所述待测样本中含有SEQIDNO.1所示序列的目的基因的起始拷贝浓度。所述SEQIDNO.1序列在所述碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM的大部分亚型中是保守的，已经发现的碳青霉烯类抗菌药物耐药基因的VIM组的41个亚型中有39个亚型包含所述SEQIDNO.1序列，本专利技术针对所述SEQIDNO.1序列设计所述引物组合，所述引物组合可以对所述碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM中包括SEQIDNO.1序列的亚型进行扩增，从而能够用于检测样本中是否存在碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM，甚至能够用于检测还未被发现的碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM的亚型。附图说明图1为本专利技术一实施例的实时荧光定量PCR扩增动力学曲线照片；图2为本专利技术一实施例的实时荧光定量PCR标准曲线照片。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，并结合附图，对本专利技术的引物组合、探针、试剂盒以及碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM的检测方法进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例提供一种引物组合，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQIDNO.2所示，所述反向引物的序列如SEQIDNO.3所示。所述正向引物和所述反向引物与所述碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM中的特定保守序列相匹配，能够用于特异性的扩增碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM，根据能否得到扩增产物判断待测样本中是否存在所述碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM。本专利技术实施例还提供一种引物组合，包括正向引物和反向引物，用于扩增碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM中如SEQIDNO.1所示的序列。所述SEQIDNO.1序列在所述碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM的大部分亚型中是保守的，已经发现的碳青霉烯类抗菌药物耐药基因的VIM组的41个亚型中有39个亚型包含所述SEQIDNO.1序列。本专利技术针对所述SEQIDNO.1序列设计所述引物组合，所述引物组合可以对所述碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM中包括SEQIDNO.1序列的亚型进行扩增，从而能够用于检测样本中是否存在碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM，甚至能够用于检测还未被发现的碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM的亚型。在其中一个实施例中，所述扩增引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQIDNO.2所示，所述反向引物的序列如SEQIDNO.3所示。所述长度的正向引物和所述反向引物使得所述扩增引物对用于扩增SEQIDNO.1序列时错配率更低、扩增效率更高。在实际应用中，所述正向引物和所述反向引物的引物序列可以存在1-3个碱基的偏差，不会影响扩增的结果。在其中一个实施例中，所述碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM包括blaVIM-1(SEQIDNO.5)、blaVIM-2(SEQIDNO.6)、blaVIM-3(SEQIDNO.7)、blaVIM-4(SEQIDNO.8)、blaVIM-5(SEQIDNO.9)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种引物组合，其特征在于，包括正向引物和反向引物，用于扩增碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM中如SEQ ID NO.1所示的序列。

【技术特征摘要】
1.一种引物组合，其特征在于，包括正向引物和反向引物，用于扩增碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM中如SEQIDNO.1所示的序列。2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述正向引物的序列如SEQIDNO.2所示，所述反向引物的序列如SEQIDNO.3所示。3.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述碳青霉烯类抗菌药物耐药基因blaVIM包括blaVIM-1、blaVIM-2、blaVIM-3、blaVIM-4、blaVIM-5、blaVIM-6、blaVIM-8、blaVIM-9、blaVIM-10、blaVIM-11、blaVIM-12、blaVIM-14、blaVIM-15、blaVIM-16、blaVIM-17、blaVIM-18、blaVIM-19、blaVIM-23、blaVIM-24、blaVIM-25、blaVIM-26、blaVIM-27、blaVIM-28、blaVIM-29、blaVIM-30、blaVIM-31、blaVIM-32、blaVIM-33、blaVIM-34、blaVIM-35、blaVIM-36、blaVIM-37、blaVIM-38、blaVIM-39、blaVIM-42、blaVIM-43、blaVIM-44、blaVIM-45和blaVIM-46中的一种或多种。4.一种探针，其特征在于，所述探针包括寡核苷酸序列、与所述寡核苷酸序列的5’端连接的荧光基团以及与...

【专利技术属性】
技术研发人员：车洁，陈霞，李娟，赵晓菲，袁敏，张云飞，卢金星，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京,11