一种同时检测三种病原菌的三重PCR检测用引物、探针、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种同时检测三种病原菌的三重PCR检测用引物、探针、试剂盒及检测方法。本发明专利技术针对Plo、ICEMh1、pspC的基因提供特异性引物，其DNA序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示；同时提供探针，其DNA序列如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.9所示。基于所述引物和探针，本发明专利技术优化了实时荧光PCR检测体系和的反应程序条件，成功建立了高通量的化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌TaqMan探针三重实时荧光定量PCR检测方法，操作简单、安全，具有更加高的灵敏度、特异性和稳定性，可以很好地满足养殖业中化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的快速检测和鉴定，同时可以分析三种菌的三个毒力基因携带情况，可用于其流行病学溯源和毒力强弱分析。

A primer, probe, kit and detection method for simultaneous detection of three pathogens in three pathogens by PCR

The invention discloses a primer, probe, reagent kit and a detection method for detecting three pathogenic bacteria simultaneously by triple PCR. The invention provides specific primers for the genes of Plo, ICEMh1 and pspC, whose DNA sequence is shown as SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6, and probes whose DNA sequence is shown as SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.9. Based on the primers and probes, the invention optimizes the real-time fluorescence PCR detection system and reaction procedure conditions, and successfully establishes a high-throughput triple real-time fluorescence quantitative PCR detection method for Cryptobacterium pyogenes, Mansonella haemolyticus and Streptococcus pneumoniae TaqMan probes. The method is simple, safe and has higher sensitivity. The specificity and stability can satisfy the rapid detection and identification of Cryptobacterium pyogenes, Mansonella haemolyticus and Streptococcus pneumoniae in aquaculture, and can also analyze the carrying of three virulence genes of the three bacteria, which can be used for epidemiological traceability and virulence analysis.

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测三种病原菌的三重PCR检测用引物、探针、试剂盒及检测方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种同时检测三种病原菌的三重PCR检测用引物、探针、试剂盒及检测方法。
技术介绍
化脓隐秘杆菌(Arcanobacteriumpyogenes)是革兰氏阳性短棒状杆菌，主要引起动物如牛、羊、猪和人多种器官的化脓性感染，如肺炎、关节炎、心内膜炎、乳房炎、脓肿、骨髓炎及子宫炎等。溶血性曼氏杆菌是一种革兰氏阴性球菌，是反刍动物最重要的呼吸道病原体之一，可引起反刍动物和野生动物流行性肺炎。肺炎链球菌为革兰氏阳性球菌，可引起多种感染的重要病原体，其在机体上呼吸道定植，在世界范围内引起一系列致命性感染，如肺炎、中耳炎、菌血症等。不同来源的化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌携带的毒力差异较大，准确、快速的检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌及其毒力基因对预防化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌病有重要的意义，也可为食源性化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的溯源和风险评估提供重要技术支持。PLO基因、ICEMh1基因和、pspC基因分别是化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的重要基因，溶血素是一种外毒素，能够溶解多种动物红细胞、免疫细胞，引起动物的死亡。ICEMh1是可动遗传因子，通常整合到宿主的染色体DNA中一个特殊的位点，在染色体复制和细胞分裂过程中被动地传播。ICEMh1也是抗菌素耐药性基因。pspC是一种表面蛋白，可刺激肺上皮细胞合成IL-8，参与宿主免疫细胞的激活和趋化作用。pspC介导对上皮细胞糖肽、唾液酸残基的黏附，通过识别并聚合Ig受体及分泌型IgA结合，促进细菌的黏附和穿透作用。传统的细菌分离鉴定的检测方法，须两次增菌培养后对可疑菌落进行生化鉴定，检测周期长达6～7d，无法满足大批量、快速检测的需求；也无法了解其携带的主要毒力基因的情况。本领域长久以来一直是采用传统的细菌生化鉴定和单重PCR(荧光PCR)方法进行化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的检测，耗时、操作繁琐、灵敏度低。且不能对化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌携带的毒力基因情况进行分析，无法法对于其进行毒力强弱的分析和流行病学溯源。无法满足对化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌风险监控的需求。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌检测技术的不足，提供一种基于Taqman探针的同时检测三种病原菌的三重PCR检测用引物、探针、试剂盒及检测方法。利用Taqman探针具有分辨率高和特异性强的优点，建立化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌特异性强、灵敏度高和具良好稳定性的高通量检测方法，并同时可以检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌携带plo基因、ICEMh1基因pspC基因三个特异基因的情况。方便化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌菌株毒力的强弱及溯源分析。本专利技术是通过以下技术方案来实现：本专利技术针对化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌，通过对化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的携带毒力基因的针对性分析，选择三个特异性的毒力基因：plo基因、ICEMh1基因pspC基因，然后根据GenBank上公布的化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌plo、ICEMh1和pspC基因序列采用DNAStar进行比对，分析序列并在其保守区域采用primerexpress3.0设计引物和探针。建立三重实时荧光定量PCR检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的方法。首先，本专利技术提供化脓隐秘杆菌plo基因、溶血性曼氏杆菌ICEMh1基因和肺炎链球菌pspC基因的实时荧光PCR检测用引物，其中：化脓隐秘杆菌的Plo基因的上、下游引物的DNA序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；溶血性曼氏杆菌的ICEMh1基因的上、下游引物的DNA序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；肺炎链球菌的pspC基因的上、下游引物的DNA序列分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。其次，本专利技术提供一种化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的TaqMan三重实时荧光PCR检测用探针，其中：化脓隐秘杆菌的Plo基因探针的DNA序列如SEQIDNO.7所示，且在该Plo基因探针的5’端标记Cy5荧光报告基团，3’端标记BHQ1；溶血性曼氏杆菌的ICEMh1基因探针的DNA序列如SEQIDNO.8所示，且在该ICEMh1基因探针的5’端标记VIC荧光报告基团，3’端标记BHQ1；肺炎链球菌的pspC基因探针的DNA序列如SEQIDNO.9所示，且在该pspC基因探针的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记BHQ1。再次，本专利技术还提供一种化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的TaqMan三重实时荧光PCR检测用试剂盒，试剂盒中的反应体系总体积为25μL，包括：PremixExTaqTM(2×)12.5μL；plo引物、探针(10μM)各0.5μL；ICEMh1引物、探针(10μM)各0.5μL；pspC引物、探针(10μM)各0.5μL；ROX0.3μL；去离子水5.7μL；DNA模板为2μL；其中，Plo基因上游引物、Plo基因下游引物和Plo基因探针的DNA序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.7所示；IICEMh1基因上游引物、IICEMh1基因下游引物和IICEMh1基因探针的DNA序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4和SEQIDNO.8所示；pspC基因上游引物、pspC基因下游引物和pspC基因探针的DNA序列分别如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6和SEQIDNO.9所示最后，本专利技术还提供一种化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌的TaqMan三重实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：S1.吸取37℃过夜培养菌液1mL置2mL离心管离心去培养基后，用1mL去离子水漂洗，12000r/min离心2min去上清，重复2次。按试剂盒说明提取DNA备用。S2.采用本专利技术设计的引物和探针和检测方法进行实时荧光PCR检测。S3.采用本专利技术建立的方法对化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌进行定量检测。优选地，S1提取DNA具体方法为：菌株用脑心浸萃液增菌培养24h后，取1mL菌液12000r/min离心去上清，采用商品化细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA作为反应的模板。优选地，S2中所述三重实时荧光PCR检测反应体系为25μL：plo、ICEMh1、pspC引物探针(10μM)分别为0.5μL，ROX0.3μL，去离子水5.7.μLDNA模板为2μL。反应条件：Stage1：预变性95℃30s；Stage2：95℃5s，60℃34s，40个循环，并于FAM、VIC，Cy5三个通道收集荧光信号；扩增反应在ABI7500FAST荧光定量PCR仪上进行。优选地，S2中所述三重实时荧光PCR检测的反应程序为：Stage1：预变性95℃30s；Stage2：95℃5s，60℃34s，40个循环，并于Cy5、VIC，FAM三个通道收集荧光信号；化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时检测三种病原菌的三重PCR检测用引物，其特征在于，同时检测的三种细菌分别为化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌；其中：化脓隐秘杆菌的Plo基因的上、下游引物溶血的DNA序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；溶血性曼氏杆菌的ICEMh1基因的上、下游引物的DNA序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；肺炎链球菌的pspC基因的上、下游引物的DNA序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

【技术特征摘要】
1.一种同时检测三种病原菌的三重PCR检测用引物，其特征在于，同时检测的三种细菌分别为化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌；其中：化脓隐秘杆菌的Plo基因的上、下游引物溶血的DNA序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；溶血性曼氏杆菌的ICEMh1基因的上、下游引物的DNA序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；肺炎链球菌的pspC基因的上、下游引物的DNA序列分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。2.一种同时检测三种病原菌的三重PCR检测用探针，其特征在于，同时检测的三种细菌分别为化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌；其中：化脓隐秘杆菌的Plo基因探针的DNA序列如SEQIDNO.7所示，且在该Plo基因探针的5’端标记Cy5荧光报告基团，3’端标记BHQ1；溶血性曼氏杆菌的ICEMh1基因探针的DNA序列如SEQIDNO.8所示，且在该ICEMh1基因探针的5’端标记VIC荧光报告基团，3’端标记BHQ1；肺炎链球菌的pspC基因探针的DNA序列如SEQIDNO.9所示，且在该pspC基因探针的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记BHQ1。3.一种同时检测三种病原菌的三重PCR检测用试剂盒，其特征在于，同时检测的三种细菌分别为化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌；试剂盒中的反应体系总体积为25μL，包括：PremixExTaqTM(2×)12.5μL；Plo基因上游引物、Plo基因下游引物、Plo基因探针；10μM，各0.5μL；IICEMh1基因上游引物、IICEMh1基因下游引物、IICEMh1基因探针；10μM，各0.5μL；pspC基因上游引物、pspC基因下游引物、pspC基因探针；10μM，各0.5μL；ROX0.3μL；去离子水5.7μL；DNA模板为2μL；其中，Plo基因上游引物、Plo基因下游引物和Plo基因探针的DNA序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.7所示；IICEMh1基因上游引物、IICEMh1基因下游引物和IICEMh1基因探针的DNA序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4和SEQIDNO.8所示；pspC基因上游引物、pspC基因下游引物和pspC基因探针的DNA序列分别如SEQIDNO....

【专利技术属性】
技术研发人员：唐婕，刘二龙，王艳，卢丽，杨超，索利娟，边坤，
申请(专利权)人：陕西省动物研究所，
类型：发明
国别省市：陕西,61