一种用于检测四种常见根结线虫的RPA引物、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测四种常见根结线虫的RPA引物、试剂盒及检测方法，属于生物安全技术领域；所述的RPA引物为如下四组：用于检测南方根结线虫的RPA引物对、用于检测爪哇根结线虫的RPA引物对、用于检测花生根结线虫的RPA引物对、用于检测象耳豆根结线虫的RPA引物对。本发明专利技术还提供含有所述的RPA引物的试剂盒。本发明专利技术进一步提供基于所述的RPA引物建立的检测方法，以样品中提取的DNA为模板进行RPA扩增反应；本发明专利技术首次将RPA技术应用到四种常见根结线虫的分子检测，其兼具特异性强、灵敏度高、检测效率高、对仪器设备要求较低的特点，对根结线虫病的现场检测、早期诊断和指导科学施药具有重要意义。

A RPA primer, kit and detection method for detecting four common root knot nematodes

The invention discloses a RAP primer, a kit and a detection method for detecting four common root-knot nematodes, belonging to the field of biosafety technology; the RPA primers are as follows: RAP primer pairs for detecting Southern Root-knot nematode, RAP primer pairs for detecting Java root-knot nematode, and for detecting peanut root-knot nematode. The RPA primer pairs were used to detect RPA primers for the root knot nematode. The invention also provides a kit containing the RPA primers. The invention further provides a detection method based on the RPA primer, which takes the DNA extracted from the sample as the template for RPA amplification reaction; the RPA technique is applied for the first time to the molecular detection of four common root-knot nematodes, which has the characteristics of strong specificity, high sensitivity, high detection efficiency and low requirements for instrumentation and equipment. It is of great significance for field detection, early diagnosis and guidance of scientific application of root knot nematode disease.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测四种常见根结线虫的RPA引物、试剂盒及检测方法
本专利技术属于生物安全
，具体地说，涉及一种用于检测四种常见根结线虫的RPA引物、试剂盒及检测方法。
技术介绍
根结线虫(Meloidogynespp.)是一类严重危害农业生产的植物线虫，能寄生蔬菜、果树、花卉和杂草等几乎所有维管植物，每年在世界范围内造成的农业损失高达百亿美元。目前，已报到的根结线虫已超过100个种，其中，危害较为严重的主要为南方根结线虫(M.incognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)、花生根结线虫(M.arenaria)、北方根结线虫(M.hapla)和象耳豆根结线虫(M.enterolobii)。近年来，随着我国种植结构的调整和设施蔬菜种植规模的扩大，特别是蔬菜大棚连作、四季重茬现象严重，导致根结线虫危害日趋严重。由于高毒化学农药的禁用以及抗病品种单基因抗性易丧失等问题的出现，使根结线虫的防治面临重大挑战。因此，快速准确鉴定根结线虫的种类对根结线虫病的测报、选择积极的防治策略提供有效手段。根结线虫种类鉴定常用手段主要包括传统的形态学鉴定、基于蛋白的同工酶鉴定技术和基于DNA的分子检测技术。形态学鉴定主要以雌虫会阴花纹、二龄幼虫头部和尾部作为重要的分类形状，该方法耗时长、需要较强的专业技能，难以推广使用。同工酶鉴定技术通过酯酶和苹果酸脱氢酶的酶谱表型来区分根结线虫不同种类，该方法只适用于鉴定雌虫，不使用于二龄幼虫和其它龄期根结线虫的鉴定，此外，该技术操作复杂、耗时长的不足也极大限制其应用。基于DNA的分子检测技术是根结线虫最常用的检测手段，主要包括随机扩增多态性DNA技术(RAPD)、特异引物PCR技术、实时荧光定量PCR技术(Real-timePCR)和环介导等温扩增技术(LAMP)。PCR技术和Real-timePCR技术具备准确、高效、灵敏度高的特点，同时可实现对根结线虫的定量检测，但该技术对仪器设备、实验条件、人员专业素质要求较高的缺点。LAMP技术可在65℃恒温1h完成检测反应，对仪器设备要求较低，但其反应体系需要6条引物，且易出现假阳性。鉴于此，继续开发精确、高效、对仪器设备要求低的根结线虫检测技术具有重要的实践价值。重组酶聚合酶扩增技术(Recombinasepolymeraseamplification，RPA)是一种新型的恒温扩增技术，其反应过程包括三种核心酶：重组酶(Recombinase)、单链结合蛋白(SSB)和DNA聚合酶(Ploymerase)。具体反应原理为：1)重组酶在ATP的参与下RPA引物结合形成核蛋白微丝，核蛋白微丝可向模板DNA移动，将引物序列与模板DNA序列进行比对；2)当引物与模板DNA发生碱基互补配对时，核蛋白微丝与模板DNA发生重组反应，并在单链结合蛋白的作用下，模板DNA解链；3)在DNA聚合酶的作用下，发生DNA的指数级扩增，形成新的DNA扩增产物。RPA技术只需一对30bp-35bp的引物，在37℃-45℃恒温反应20min即可完成扩增反应，检测时间较用常用分子检测手段大大降低。目前，RPA技术已广泛应用于病毒、细菌、支原体和动物寄生线虫的快速检测中，但尚未见其根结线虫检测方面的报道。
技术实现思路
1、要解决的问题针对四种常见根结线虫尚无有效运用RPA技术进行检测的问题，本专利技术提供一种用于检测四种常见根结线虫的RPA引物、试剂盒及检测方法，它可以显著高检测效率，为四种常见根结线虫的早期诊断和现场快速检测提供新技术。2、技术方案为解决上述问题，本专利技术采用如下的技术方案。一种用于检测四种常见根结线虫的RPA引物，所述的RPA引物为如下四组所示，用于检测南方根结线虫的RPA引物对：(A)SEQIDNo：1和SEQIDNo：2；用于检测爪哇根结线虫的RPA引物对：(B)SEQIDNo：3和SEQIDNo：4；用于检测花生根结线虫的RPA引物对：(C)SEQIDNo：5和SEQIDNo：6；用于检测象耳豆根结线虫的RPA引物对：(D)SEQIDNo：7和SEQIDNo：8。优选地，A组中SEQIDNo：1和SEQIDNo：2组成的引物对所获得的电泳条带如图1所示。优选地，B组中SEQIDNo：3和SEQIDNo：4组成的引物对所获得的电泳条带如图1所示。优选地，C组中SEQIDNo：5和SEQIDNo：6组成的引物对所获得的电泳条带如图1所示。优选地，D组中SEQIDNo：7和SEQIDNo：8组成的引物对所获得的电泳条带如图1所示。一种用于检测四种常见根结线虫的试剂盒。一种用于检测四种常见根结线虫的检测方法，包括以下步骤：(1)提取样品中的DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用上述所述的RPA引物进行RPA扩增反应；(3)分析RPA扩增产物。优选地，步骤(2)中RPA扩增反应的反应体系以50μL计为：优选地，步骤(2)中RPA扩增反应的反应条件为：37℃-45℃(具体应用时，可以选择37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃等数值)下反应20min，随后冰上终止反应。优选地，步骤(3)中分析RPA扩增产物的方法为利用琼脂糖凝胶电泳技术分析。3、有益效果相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：本专利技术RPA引物、试剂盒及检测方法，为四种常见根结线虫的检测提供了新技术，首次将RPA技术应用到四种常见根结线虫的分子检测，其兼具特异性强、灵敏度高、检测效率高、对仪器设备要求较低的特点，对根结线虫病的现场检测、早期诊断和指导科学施药具有重要意义；其中RPA引物分别基于四种常见根结线虫SCAR序列设计，可稳定扩增且特异性较高，实现四种常见根结线虫的检测准确率高；其中试剂盒和检测方法具有较高的检测灵敏度，同时可在常温下和20min内完成对四种常见根结线虫DNA的恒温扩增，检测效率远高于较传统生理生化检测方法甚至PCR检测方法，解决了现有常规技术存在检测方法所需时间较长、对仪器设备依赖性高、检测结果假阳性高的现象。由此可见，建立的四种常见根结线虫RPA检测方法操作简单且结果易判定，为四种常见根结线虫的现场检测或快速检测提供有力技术支持。附图说明图1为实施例2四种常见根结线虫RPA检测方法建立的检测结果图；图2为实施例3四种常见根结线虫RPA引物的特异性检测结果图；图3为实施例4四种常见根结线虫RPA检测方法的灵敏度检测结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进一步进行描述。以下实施例中使用的RPA反应管以及反应缓冲液购自英国TwistDX公司，商品编号TABAS03KIT；其中，重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶以RPA冻干粉状态存在于RPA反应管中，使用时，用反应缓冲液溶解，整个RPA扩增反应在RPA反应管中进行。实施例1四种常见根结线虫RPA引物的设计和筛选以已报道的四种常见根结线虫SCAR序列为靶基因，依据RPA引物设计原则，设计可用于RPA试剂盒(TwistAmpBasic)的RPA引物。将四种常见根结线虫DNA分别用于RPA引物的筛选，获得扩增效率高、灵敏度和特异性最好的四组RPA引物对，它们的序列如下：用于检测南方根结线虫的RPA引物对：上游引物Mi-RPA-F(SEQIDNo.1)：5’-GTAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测四种常见根结线虫的RPA引物，其特征在于：所述的RPA引物为如下四组所示，用于检测南方根结线虫的RPA引物对：(A)SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；用于检测爪哇根结线虫的RPA引物对：(B)SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；用于检测花生根结线虫的RPA引物对：(C)SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；用于检测象耳豆根结线虫的RPA引物对：(D)SEQ ID No：7和SEQ ID No：8。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测四种常见根结线虫的RPA引物，其特征在于：所述的RPA引物为如下四组所示，用于检测南方根结线虫的RPA引物对：(A)SEQIDNo：1和SEQIDNo：2；用于检测爪哇根结线虫的RPA引物对：(B)SEQIDNo：3和SEQIDNo：4；用于检测花生根结线虫的RPA引物对：(C)SEQIDNo：5和SEQIDNo：6；用于检测象耳豆根结线虫的RPA引物对：(D)SEQIDNo：7和SEQIDNo：8。2.根据权利要求1所述的用于检测四种常见根结线虫的RPA引物，其特征在于：A组中SEQIDNo：1和SEQIDNo：2组成的引物对所获得的电泳条带如图1所示。3.根据权利要求1所述的用于检测四种常见根结线虫的RPA引物，其特征在于：B组中SEQIDNo：3和SEQIDNo：4组成的引物对所获得的电泳条带如图1所示。4.根据权利要求1所述的用于检测四种常见根结线虫的RPA引物，其特征在于：C组中SEQIDNo：5和SEQIDNo：6组成的引物对所获得的电泳条带如图1所示。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：鞠玉亮，操海群，潘月敏，林宇，吴慧平，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34