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一种用于突发性弱精辅助诊断的生物标志物及其应用制造技术

技术编号:19002444 阅读:57 留言:0更新日期:2018-09-22 05:58
本发明专利技术涉及一种用于突发性弱精辅助诊断的生物标志物及其应用。所述CpG甲基化位点在外周血白细胞DAZ3基因启动子区。所述试剂盒包括检测上述甲基化位点的定量PCR引物。在本发明专利技术中,外周血白细胞较易获得,无需其他组织,属于无创性检查;外周血白细胞DAZ3基因启动子区甲基化反映的是机体整体的病理、生理情况,以其作为突发性弱精辅助诊断的生物标志物可以提高检测的准确性;所述试剂盒简化了定量PCR引物库,减少制作成本和生产时间,增加了针对性和实用性,提高了检测的灵敏度和特异性;所述标志物、方法、试剂盒能够用于突发性弱精辅助诊断。

Biomarker for auxiliary diagnosis of sudden weak sperm and its application

The invention relates to a biomarker for auxiliary diagnosis of paroxysmal asthenospermia and its application. The CpG methylation site is located in the promoter region of DAZ3 gene in peripheral blood leukocytes. The kit comprises a quantitative PCR primer for detecting the methylation sites. In the present invention, peripheral blood leukocytes are easy to obtain without other tissues and belong to non-invasive examination; the methylation of DAZ3 gene promoter region in peripheral blood leukocytes reflects the overall pathological and physiological conditions of the body, and can be used as a biomarker for assistant diagnosis of paroxysmal asthenospermia to improve the accuracy of detection; and the reagent described in the present invention is suitable for the diagnosis of paroxysmal asthenosper The kit simplifies the primer Library of quantitative PCR, reduces the production cost and time, increases the pertinence and practicability, improves the sensitivity and specificity of detection, and the markers, methods and kits can be used for assistant diagnosis of paroxysmal asthenospermia.

【技术实现步骤摘要】
一种用于突发性弱精辅助诊断的生物标志物及其应用
本专利技术属于生物
,涉及一种用于突发性弱精辅助诊断的生物标志物及其应用。
技术介绍
引起男性弱精症的因素复杂,有遗传因素、生殖道感染及精索静脉曲张等,其中遗传缺陷是引起男性无精及弱精症的重要原因之一。染色体数量或者结构异常可以引起男性生殖器官异常,影响精子的发生进而降低其生育能力。本病以克氏综合征多见,核型为47,XXY。发病机制是X染色体在减数分裂时不分离,导致患者睾丸小而质硬,睾酮合成功能低下,发生严重弱精或无精子症。突发性弱精属弱精症的一种,但其病因尚不明确。患有突发性弱精的男性临床表现为生殖器官结构和功能均正常,可正常排精,精液常规检查除了精子活力低下这一项,其余指标均在参考范围内。研究表明,Y染色体长臂上AZF(azoospermiafactor)基因与男性不育密切相关。AZF划分为AZFa、AZFb、AZFc3个相互独立的区域,这些区域包括一些影响男胚细胞发育和维持的基因和基因家族,会影响精子的发生。Reijo利用Y染色体特异性DNA探针发现了成人睾丸组织转录编码一种与减数分裂相关的RNA结合蛋白的基因DAZ(deletedinazoospermia),它恰恰在AZFc区域中。该基因在减数分裂前期的生殖细胞,尤其是精原细胞,发育中的各期精子细胞以及精子尾部均有表达,提示其在精子发生的各期均有调控作用。临床实验室通过G显带技术对患者的染色体进行检测。操作人员将中期染色体制片经胰酶处理后,再用吉姆萨进行染色,得到染色体区带。然而,G显带技术只能显示染色体带的位置、宽度和深浅等,无法对染色体结构进行更细微的分辨。而患有突发性弱精的男性其染色体检测结果是正常的。其他对突发性弱精的主要检查手段有精液常规、激素检测、B超等。但这些均为疾病排除性检测,不可辅助诊断。近年来,随着分子生物技术的不断发展,利用荧光原位杂交技术,将荧光素标记的探针进行染色体核型特定位点的检测和标记,可以精确地检测染色体上DNA链单个碱基的突变/缺失,从而大大提高染色体核型分析的精度。比如Mozdarani推荐的PRINS和FISH两种技术相结合方法对精子胞核中DAZ基因微缺失进行筛查检测,但由于其处理程序繁琐,对实验人员操作技术要求高,因而未在临床上推广应用。当前,尚没有利用无创伤性、取材方便的血液样本检测与突发性弱精辅助诊断的生物标志物相关的特异性定量PCR引物及检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的上述不足,提供一个用于突发性弱精辅助诊断的CpG甲基化位点。本专利技术的另一目的是提供一种用于突发性弱精辅助诊断的CpG甲基化位点定量PCR引物。本专利技术的又一目的是提供所述的CpG甲基化位点或其定量PCR引物的应用。本专利技术的目的通过以下技术方案实现:一个用于突发性弱精辅助诊断的CpG甲基化位点,该CpG位点在外周血白细胞DAZ3基因启动子区;所述的DAZ3基因启动子区CpG位点位置为:-312~-313。上述定量PCR引物的筛选方法包括以下步骤(见图1):(1)分别收集17例有子嗣的健康男性和13例年龄相匹配的患有突发性弱精男性的EDTA抗凝全血样本,提取总DNA;(2)采用商品化试剂盒EZ-96DNAmethylationkit(Zymoresearch公司)对DNA进行亚硫酸氢盐处理;(3)使用Methprimer服务器设计用于DAZ1-3基因启动子区CpG位点甲基化水平定量检测的PCR引物;(4)采用高灵敏度、高精确性和高重复性的SequenomMassARRAY甲基化定量检测分析平台(CapitalBio公司)进行DAZ1-3基因启动子区CpG位点定量检测,筛选在有子嗣的健康男性和突发性弱精男性间存在差异甲基化水平的CpG位点;(5)用实时荧光定量PCR方法对一组样本进行逐个检测,复筛出甲基化水平差异显著的CpG位点;(6)进一步用实时荧光定量PCR方法对其他样本进行逐个验证,筛选出稳定的甲基化水平差异显著的CpG位点;(7)用实时荧光定量PCR方法对100例有子嗣的健康男性EDTA抗凝血样本进行逐个检测,确定健康男性外周血白细胞DAZ3基因启动子区该CpG位点甲基化检测结果ΔCT值参考范围。具体来说,上述筛选方法包括以下步骤:(1)收集有子嗣的健康男性和年龄相匹配的患有突发性弱精男性的EDTA抗凝全血样本,提取总DNA;(2)对上述DNA进行亚硫酸氢盐处理;(3)设计用于CpG位点甲基化水平定量检测的测序引物;(4)运用SequenomMassARRAY甲基化定量检测分析平台进行CpG位点甲基化水平定量检测,初筛出在有子嗣的健康男性和患有突发性弱精男性间存在差异甲基化水平的CpG位点;(5)采用荧光定量PCR对初筛出的CpG位点进行复筛;(6)进一步用实时荧光定量PCR方法对其他样本进行逐个验证,挑选出稳定、甲基化水平差异显著的CpG位点;(7)采用荧光定量PCR确定健康男性外周血白细胞DAZ3基因启动子区该CpG位点甲基化检测结果ΔCT值参考范围。一种用于突发性弱精辅助诊断的CpG甲基化位点定量PCR引物,该定量PCR引物由本专利技术所述的CpG位点的定量PCR引物组成。所述CpG位点的定量PCR引物序列优选如SEQIDNo.1和No.2所示。表1上述定量PCR引物为以下序列所示的定量PCR引物:本专利技术所述的CpG甲基化位点作为检测靶点在制备突发性弱精辅助诊断的试剂或工具中的应用。本专利技术所述的定量PCR引物在制备突发性弱精辅助诊断的试剂或工具中的应用。一种用于突发性弱精辅助诊断的试剂盒,该试剂盒包含本专利技术所述的定量PCR引物。所述试剂盒包括Sybergreen、内参定量PCR引物和该定量PCR引物(英潍捷基公司提供)。本专利技术使用的检测方法可以选自:RT-PCR方法、Real-timePCR方法中的一种或几种。例如,EDTA抗凝全血样本中DAZ3基因启动子区CpG位点(-312~-313)甲基化水平检测方法包括以下步骤:(1)使用DNAbloodminikit(Qiagen公司)提取外周血白细胞总DNA;(2)采用商品化试剂盒EZ-96DNAmethylationkit(Zymoresearch公司)对DNA进行亚硫酸氢盐处理;(3)利用定量PCR引物法进行PCR反应;(4)读取CT值。本专利技术的有益效果:通过对有子嗣的健康男性和患有突发性弱精男性的外周血白细胞DAZ基因启动子区CpG位点甲基化水平进行检测和比对,分析DAZ基因启动子区CpG位点甲基化水平与精子活力的关系,联系患者的染色体、精液常规、B超、激素等其他临床实验室检查结果,筛选一个与突发性弱精相关的外周血白细胞DAZ基因启动子区CpG甲基化位点,并利用这个位点的定量PCR引物制备出适用于临床辅助诊断用途的试剂盒,为突发性弱精患者提供特异性的以及迅速的无创伤性检测手段。首先,EDTA抗凝全血样本相对其他组织较易获得,与精液常规检查相比,检测前无需做特殊准备,极大地方便了医疗人员的使用,更减少了患者的不便;其次,外周血白细胞DAZ基因启动子区CpG位点甲基化水平反映的是机体整体的病理、生理情况,其检测结果具有精确而详细的指导意义;第三,所筛选出的CpG位点对突发性弱精辅助诊断的特异性和灵敏本文档来自技高网
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一种用于突发性弱精辅助诊断的生物标志物及其应用

【技术保护点】
1.一个用于突发性弱精辅助诊断的CpG甲基化位点,其特征在于该CpG位点在外周血白细胞DAZ3基因启动子区;所述的DAZ3基因启动子区CpG位点位置为:‑312~‑313。

【技术特征摘要】
1.一个用于突发性弱精辅助诊断的CpG甲基化位点,其特征在于该CpG位点在外周血白细胞DAZ3基因启动子区;所述的DAZ3基因启动子区CpG位点位置为:-312~-313。2.一种用于突发性弱精辅助诊断的CpG甲基化位点定量PCR引物,其特征在于该定量PCR引物由权利要求1所述的CpG位点的定量PCR引物组成。3.根据权利要求2所述的定量PCR引物,其特征在于所述CpG位点的定量PCR引物序列为:SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员:张洁心张世昌
申请(专利权)人:张洁心张世昌
类型:发明
国别省市:江苏,32

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