第1708位点发生突变的人类IBGC致病基因XPR1及其检测方法技术

本发明专利技术涉及第1708位点发生突变的人类IBGC致病基因XPR1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体是野生型基因第1708位的C突变为T。本发明专利技术提供的致病基因形式尚未被报道，可以为该病致病机理的解析和药物开发、致病基因筛查和检测以及治疗方案的制定等提供依据和奠定基础。同时本发明专利技术构建了致病基因检测方法：首先利用多重PCR捕获致病基因外显子区域，再对其进行二代测序、通过信息分析找出突变，最后利用Sanger测序对突变进行验证；其中PCR捕获引物组包含扩增引物序列SEQ ID NO.12‑23，Sanger测序片段的扩增引物序列如SEQ ID NO.34‑35所示。本发明专利技术检测方法可以高效全面、快速准确地获取突变信息。

Human IBGC pathogenic gene XPR1 with mutation at 1708th locus and its detection method

The present invention relates to a human IBGC pathogenic gene XPR1 mutated at site 1708. Its nucleotide sequence is as shown in SEQ ID NO. 7, specifically the C mutation at site 1708 of the wild type gene is T. The pathogenic gene form provided by the invention has not been reported, which can provide the basis and lay the foundation for the pathogenic mechanism analysis and drug development, pathogenic gene screening and detection, and the formulation of treatment scheme, etc. At the same time, the invention constructs a method for detecting pathogenic genes: firstly, the exon region of the pathogenic gene is captured by multiplex PCR, then the mutation is sequenced by the second generation of PCR, and the mutation is identified by information analysis. Finally, the mutation is verified by Sanger sequencing. The PCR capture primer group contains the amplified primer sequence SEQ ID NO.12_23 and Sanger detection. Primer sequences for sequence fragments are shown in SEQ ID NO.34 35. The detection method of the invention can obtain the mutation information efficiently, comprehensively, quickly and accurately.

【技术实现步骤摘要】
第1708位点发生突变的人类IBGC致病基因XPR1及其检测方法本案是专利申请No.201710071474.9(申请日为：2017年2月9日，专利技术名称为：人类特发性基底节钙化致病基因及其检测方法)的分案申请。
本专利技术涉及基因及其检测方法，特别涉及第1708位点发生突变的人类IBGC致病基因XPR1及其检测方法。
技术介绍
人类特发性基底节钙化(IdiopathicBasalGang1iaCalcification,IBGC)是一种以影像学上基底节及脑其它部位对称性钙化为特征的神经系统变性遗传病,也称Fahr病。钙化最常见的部位为基底节区豆状核，尤其是苍白球，也常见于壳核、丘脑、尾状核及小脑齿状核等部位，甚至出现在大脑皮层及皮层下白质。IBGC属罕见病，呈散发或家族性发病，家族性患者发病年龄逐代提前，进展缓慢、病程较长。该病无明显性别差异，表现为复杂多样的运动损害和行为症状的组合，同一家族中的不同成员之间临床症状往往存在差异。临床表现以神经、精神功能紊乱为主，轻者仅仅为轻度注意力或记忆力的下降，重者则会出现人格及行为改变，终致精神病或痴呆。IBGC有家族性发病的现象，常染色体显性遗传和隐性遗传的病例均有报道，以常染色体显性遗传居多。遗传性IBGC相关致病基因和发病机制长期以来并未得到解析，直到2012年Liu等人在IBGC3基因位点中，通过连锁分析、单倍体分析、Sanger测序等成功克隆特发性基底节钙化的致病基因SLC20A2，并且在不同种族中得到验证；此后，PDGFRB、PDGFB和XPR1这三个致病基因陆续被发现和得到验证。其中，SLC20A2基因编码的蛋白为钠-磷共转运体(PiT2)，参与机体的钙磷调节；PDGFRB基因编码血小板衍生生长因子受体PDGFRβ，属于III型受体酪氨酸激酶家族；PDGFB基因则编码血小板衍生生长因子PDGF-B，与PDGFBβ结合可激活下游信号通路，参与细胞的增殖、分化、生存以及迁移；XPR1基因编码的蛋白含有SPX结构域，主要参与磷稳态的维持，具有Pi输出功能。为了系统解析IBGC致病基因突变，本专利技术设计和合成了覆盖4个已知致病基因的PCR捕获引物组，并结合二代测序技术对10个IBGC患者样本进行捕获测序，共分析得出了1种SLC20A2基因突变、2种PDGFRB基因突变、2种PDGFB基因突变和2种XPR1基因突变，所发现的突变均经Sanger测序确证；之后针对各自的致病基因突变，利用Sanger测序分析对应的家系中其它成员的样本，全部符合基因型-表型共分离规律从而致病基因突变得到了验证。进一步的，采用同样的方法在另外12个IBGC患者和200个正常人样本中进行了验证。本专利技术提供的IBGC致病基因突变尚未见报道，其对于该病的解析、筛查、检测和治疗具有潜在的重要价值。此外，本专利技术基于PCR捕获结合二代测序(简称PCR捕获测序)构建的IBGC致病基因检测方法，可以同时全面解析4种IBGC致病基因突变谱，具有通量高、灵敏度高、可解析未知突变的优点。目前，国内外均没有该方法在IBGC致病基因SLC20A2，PDGFRB，PDGFB，XPR1突变同时检测方面应用的报道。由于单次反应测序长度的限制(1000bp以内)，传统的基于Sanger测序的方法进行的全面解析，费用高昂且费时费力。而基于实时荧光定量PCR的突变检测方法，则只能针对少量已知的突变。
技术实现思路
本专利技术提供了IBGC相关的4个致病基因的7种突变基因形式，同时提供了基于PCR捕获测序的检测方法；这些可以为IBGC致病机理的解析和药物开发、致病基因筛查和检测以及治疗方案的制定等提供依据和奠定基础。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案如下：本专利技术提供了IBGC的7种致病基因形式，包括1种SLC20A2突变基因，其序列如SEQIDNO.1所示；2种PDGFRB突变基因，其序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示；2种PDGFB突变基因，其序列如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示；和2种XPR1突变基因，其序列如SEQIDNO.6和SEQIDNO.7所示。所述涉及SLC20A2、PDGFRB、PDGFB和XPR1这4个基因共7种突变基因类型经检测和验证，均为IBGC致病基因。其中，SLC20A2突变基因的突变位点在Exon7中，具体是野生型基因第799位的G突变为C；PDGFRB突变基因的突变位点其一在Exon2中，具体是野生型基因第3位的G突变为A,其二在Exon16中，具体是野生型基因第2209位的G突变为A；PDGFB突变基因的突变位点其一在Exon3中，具体是野生型基因第220位的G突变为T，其二也在Exon3中，具体是野生型基因第232位的C突变为T；XPR1突变基因的突变位点其一在Exon5中，具体是野生型基因第490位的G突变为T，其二在Exon13中，具体是野生型基因第1708位的C突变为T。由于突变发生在外显子区，因此本专利技术提供的SEQIDNO.1-7为编码区序列。另外，提供的SEQIDNO.8-11分别是SLC20A2，PDGFRB，PDGFB，XPR1的野生型基因的编码区序列，供参比。本专利技术提供的基于PCR捕获测序的IBGC致病基因检测方法(参见图1)包括如下主要步骤：(1)4个致病基因的PCR捕获提取待测样本基因组DNA，利用设计合成的PCR捕获引物组进行扩增；(2)二代测序解析基因突变谱将(1)中的多重PCR扩增产物进行二代测序，并通过信息分析找出突变位点；(3)突变位点的验证对于结果是已知突变的，则将原样本突变片段扩增后直接进行Sanger测序验证；对于结果是新发现突变的，则根据情况设计引物将原样本突变片段扩增后直接进行Sanger测序验证后，再通过Sanger测序分析患者家系相关成员样本的基因型-表型共分离情况进行验证。其中，(1)中所述PCR捕获引物组是利用美国ThermoFisher公司的在线软件IonAmpliSeqDesigner进行设计的，至少应该捕获所述所有7种突变形式其突变位点所在区域，结果显示至少需要SEQIDNO.12-23这12条序列。优选地，可以针对SLC20A2、PDGFRB、PDGFB和XPR1这4个基因所有外显子及其侧翼序列，使得目标基因覆盖率达100％，结果共获得了69对引物，其序列如表1所示。表1PCR捕获扩增引物组其中，(1)中进行的多重PCR扩增体系(20ul)如表2所示。5XIonAmpliSeqTMHiFiMix、2XIonAmpliSeqTM引物组和20XIonAmpliSeqTMSampleIDPanel均购置于美国ThermoFisher公司。表2PCR捕获扩增体系成分添加量(ul)5XIonAmpliSeqTMHiFiMix42XIonAmpliSeqTM引物组1020XIonAmpliSeqTMSampleIDPanel1浓度>20ng/ul的样本基因组DNA0.5灭菌的Nuclease-freeWater4.5其中，(1)中所述的多重PCR扩增阶段和条件如表3所示：表3PCR捕获扩增阶段和条件其中，(2)中所述的PCR扩增捕获产物进行的二代测序和信息分析，有二代测序仪和配套分析软件则按照规范操作和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.第1708位点发生突变的人类IBGC致病基因XPR1，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体是野生型基因第1708位的C突变为T。

【技术特征摘要】
1.第1708位点发生突变的人类IBGC致病基因XPR1，其特征在于其核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，具体是野生型基因第1708位的C突变为T。2.根据权利要求1所述的第1708位点发生突变的人类IBGC致病基因XPR1的检测方法,其特征在于致病基因XPR1检测方法的主要步骤如下:(1)致病基因XPR1的PCR捕获提取待测样本基因组DNA，利用设计合成的PCR捕获引物组进行扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈万金，赵淼，姚香平，苏惠贞，王冲，王柠，
申请(专利权)人：福建医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：福建,35