一种基因表达增强元件及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基因表达增强元件EE，所述增强元件能够提高基因的表达效率，将该元件用于大肠杆菌中外源基因的表达，不仅能够提高基因的表达量，还能够使得蛋白的可溶性表达形式增加，为利用大肠杆菌表达外源蛋白提供了新的思路。

A gene expression enhancement element and its application

The invention discloses a gene expression enhancement element EE, which can improve the expression efficiency of genes. The element is applied to the expression of foreign genes in Escherichia coli, which can not only increase the expression of genes, but also increase the soluble expression form of proteins, so as to express foreign proteins in Escherichia coli. New ideas are provided.

【技术实现步骤摘要】
一种基因表达增强元件及其应用
：本专利技术属于生物
，具体涉及一种可以提高基因表达效率的增强元件。
技术介绍
：随着分子生物学技术的飞速发展，利用细菌获得有科研或商业价值的蛋白质已成为最廉价且简捷的生产方法。在众多的表达体系中，大肠杆菌(Escherichiacoli)因其安全性好、生长周期短、生理及遗传学特征明确和操作简单等特点，应用最为广泛。但是，在利用大肠杆菌表达异源蛋白时，会出现不表达或是以不溶性包涵体的形式存在等问题，大大制约了蛋白质的进一步研究和应用。目前，包涵体形式的蛋白主要采用一系列变性复性的方法得到可溶性的活性蛋白，但是，蛋白质复性后仍可能出现错误折叠的现象。近年来，越来越多的研究倾向于直接在大肠杆菌中获得表达量高且具有活性的蛋白质。目前常见的优化技术包括：(1)采用不同的启动子；(2)优化异源蛋白基因的密码子；(3)构建融合蛋白；(4)优化大肠杆菌的生长条件以减缓蛋白质的合成速率等。虽然这些方法能够改善蛋白质的可溶性，但仍然有大量的蛋白质在大肠杆菌的表达系统中无法达到理想的预期产量，甚至根本不表达。因此，构建一个更为有效且广谱的高表达质粒显得尤为重要。为了提高基因的表达效率，专利技术人基于前期的工作，构建了一种基因表达增强元件，将该元件用于大肠杆菌中外源基因的表达，不仅能够提高基因的表达量，还能够使得蛋白的可溶性表达形式增加，为利用大肠杆菌表达外源蛋白提供了新的思路。
技术实现思路
：本专利技术一方面提供了一种基因表达增强元件EE，该增强元件EE的核酸序列如SEQIDNo.1所示。另一方面，本专利技术提供了含有增强元件EE的表达盒，所述表达盒包括5’到3’依次连接的启动子和增强元件EE；优选的，在启动子和增强元件EE之间还连接有核糖体结合位点；更优选的，在增强元件EE的3’端连接有多克隆位点区域；优选的，在增强元件EE的3’端连接有目的基因；优选的，目的基因置于多克隆位点区域。在一个实施方式中，本专利技术所述的启动子选自Lac启动子、Trp启动子、Tac启动子、Trc启动子、IPL启动子和T7启动子中的一种或任意组合。另一方面，本专利技术提供了含有所述基因表达增强元件的重组载体，所述初始载体优选pET表达载体，优选，pET21a、pET11a、pET22b、pET28a、pET29a、pETM-11，更优选，pETM-11。在一个实施方式中，所述初始载体为pETM-11，所述增强元件置于载体T7启动子和多克隆位点之间；优选的，置于核糖体结合位点和多克隆位点之间；更优选的，置于核糖体结合位点和组氨酸标签之间。另一方面，本专利技术提供了含有基因表达增强元件或所述重组载体的宿主细胞，所述宿主细胞优选原核细胞，更优选，大肠杆菌，更优选，大肠杆菌JM101、JM105、JM109、JM110、BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS、DH5α，DH5αλpir，Top10、Rosettalblue(DE3)、Rosetta(DE3)、Rosetta(DE5)、Rosetta(DE3)plysS、Orgami(DE3)、OrgamiB(DE3)、Orgami(DE3)plysS、Rosetta-gami2(DE3)plysS、Rosetta-gami(DE3)、Rosetta-gamiB(DE3)、Rosetta-gamiB(DE3)plysS。另一方面，本专利技术还提供了SEQIDNo.1所述基因表达增强元件、包含增强元件的表达盒、重组载体或宿主细胞的用途，所述用途为进行基因的表达，所述宿主细胞优选大肠杆菌；在一个实施方式中，所述用途为提高基因的表达效率，优选的，所述表达效率为提高目的蛋白的表达量和/或促进蛋白的可溶性表达；优选的，所述基因为外源基因，更优选的，所述基因为gfp和eseD基因。本文所述的“促进蛋白的可溶性表达”是指，更多的重组蛋白以可溶性的形式进行表达，表达得到的总重组蛋白包含沉淀中的重组蛋白和可溶性组分中的重组蛋白。促进蛋白的可溶性表达，意味着，可溶性的重组蛋白占总重组蛋白的比例增多。另一方面，本专利技术还提供了利用SEQIDNo.1所述基因表达增强元件、包含增强元件的表达盒、载体或宿主细胞表达基因的方法；所述方法包括将目的基因置于SEQIDNo.1所述基因表达增强元件的3’端组成基因表达盒的步骤；优选的，所述方法还包括，将所述基因表达盒连接到表达载体上得到重组表达载体的步骤；更优选的，还包括将所述重组表达载体转化到宿主细胞中进行表达的步骤；更优选的，所述表达载体为pET表达载体；更优选的，所述pET表达载体选自pET21a、pET11a、pET22b、pET28a、pET29a或pETM-11；更优选的，所述pET表达载体为pETM-11；更优选的，所述宿主细胞为原核细胞；更优选的，所述原核细胞为大肠杆菌；更优选的，所述大肠杆菌为大肠杆菌JM101、JM105、JM109、JM110、BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS、DH5α，DH5αλpir，Top10、Rosettalblue(DE3)、Rosetta(DE3)、Rosetta(DE5)、Rosetta(DE3)plysS、Orgami(DE3)、OrgamiB(DE3)、Orgami(DE3)plysS、Rosetta-gami2(DE3)plysS、Rosetta-gami(DE3)、Rosetta-gamiB(DE3)或Rosetta-gamiB(DE3)plysS。优选的，所述基因对于宿主细胞来说是外源基因。另一方面，本专利技术还提供了重组载体的构建方法，所述方法包括将基因表达增强元件或包含增强元件的表达盒连接到表达载体的步骤；所述连接选择酶切连接和/或PCR融合；优选的，基因表达增强元件置于载体的启动子之后，更优选的，置于启动子和多克隆位点之间，更优选的，置于核糖体结合位点和多克隆位点之间。附图说明：图1：质粒pLYJ及相关质粒构建示意图。A，质粒pLYJ构建示意图，其中，rbs：核糖体结合位点；MCS：多克隆位点；EE：基因表达增强元件；B，质粒pLYJ194和pLYJ163构建示意图；C，对照组质粒pETM-11+gfp和pETM-11+eseD的构建示意图。图2：GFP和EseD在不同质粒中的相对表达水平；其中，GFP采用荧光强度检测，EseD采用蛋白量检测。图3：对照组pETM-11和实验组pLYJ中EseD表达和纯化电泳图，箭头处为重组蛋白EseD的电泳位置，实验组和对照组所采用的表达、纯化、电泳、上样量的条件参数均相同。A，诱导表达后的菌体总蛋白(含可溶性组分以及沉淀不溶组分)，对照组：pETM-11，实验组：pLYJ，采用质粒pLYJ表达的菌体总蛋白量明显增多，并且，EseD的表达量也明显增多。B，诱导表达后的不溶性蛋白，对照组：pETM-11，实验组：pLYJ，采用质粒pLYJ表达的EseD蛋白量明显增多。C，对照质粒pETM-11蛋白表达纯化电泳图；D，实验组pLYJ蛋白表达纯化电泳图；上清：超声破碎后的可溶性总蛋白样品；穿透峰样品：未与镍柱结合的蛋白质样品；纯化样品：最终纯化得到的蛋白质样品；采用质粒pLYJ表达的可溶性总蛋白量明显增多，并且纯化得到的重组EseD蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因表达增强元件EE，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种基因表达增强元件EE，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.一种基因表达盒，其特征在于，所述表达盒包括5’到3’依次连接的启动子和基因表达增强元件，所述增强元件为权利要求1所述的增强元件EE；优选的，在启动子和增强元件之间还连接有核糖体结合位点；更优选的，在增强元件的3’端连接有多克隆位点区域；更优选的，在增强元件的3’端连接有目的基因；更优选的，目的基因连接在多克隆位点区域。3.如权利要求2所述的基因表达盒，其特征在于，所述启动子选自Lac启动子、Trp启动子、Tac启动子、Trc启动子、IPL启动子和T7启动子中的一种或任意组合，优选，T7启动子。4.包含权利要求1所述增强元件EE的重组载体；优选的，所述初始载体为pET表达载体；更优选的，所述pET表达载体选自pET21a、pET11a、pET22b、pET28a、pET29a或pETM-11；更优选的，所述pET表达载体为pETM-11。5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述初始载体为pETM-11，所述增强元件置于T7启动子和多克隆位点之间；优选的，置于核糖体结合位点和多克隆位点之间；更优选的，置于核糖体结合位点和组氨酸标签之间。6.包含权利要求4-5所述重组载体的宿主细胞；优选的，所述宿主细胞为原核细胞；更优选的，所述原核细胞为大肠杆菌；更优选的，所述大肠杆菌为大肠杆菌JM101、JM105、JM109、JM110、BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS、DH5α，DH5αλpir，Top10、Rosettalblue(DE3)、Rosetta(DE3)、Rosetta(DE5)、Rosetta(DE3)plysS、Orgami(DE3)、OrgamiB(DE3)、Orgami(DE3)plysS、Rosetta-gami2(DE3)plysS、Rosetta-gami(DE3)、Rosetta-gamiB(DE3)或Rosetta-gamiB(DE3)plysS。7.权利要求1的增强元件EE、权利要求2-...

【专利技术属性】
技术研发人员：马庆军，李颖杰，张碧夏，龚艳玲，于锦然，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37