重组酶UvsX的制备方法、表达基因及重组表达载体技术

本发明专利技术涉及一种重组酶UvsX的制备方法、表达基因及重组表达载体。一种重组酶UvsX的表达基因，包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。上述表达基因编码的重组酶uvsX基因能够在大肠杆菌中实现大量可溶性表达，且表达的重组酶UvsX的纯度大于95％。

Preparation, expression gene and recombinant expression vector of recombinant enzyme UvsX

The invention relates to a preparation method of recombinant enzyme UvsX, an expression gene and a recombinant expression vector. An expression gene of recombinant enzyme UvsX, including the nucleotide sequence shown in SEQ ID No.1. The recombinant enzyme uvsX gene encoded by the above genes could be expressed in E. coli in a large amount of soluble form, and the purity of the recombinant enzyme UvsX was more than 95%.

【技术实现步骤摘要】
重组酶UvsX的制备方法、表达基因及重组表达载体
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种重组酶UvsX的制备方法、表达基因及重组表达载体。
技术介绍
DNA扩增在许多分子生物学检测方法中都是非常关键的一步。PCR是在1986年就发展起来的应用最为广泛的DNA扩增技术，常用于检测、鉴定传染性疾病、基因突变以及其他方面。然而，这种经典的技术需要一个温度循环仪器使双链DNA解链，再在等温条件下扩增目的片段。随着分子生物学的不断发展，重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，RPA)技术使不借助精密温度循环系统进行等温核酸扩增逐渐成为可能。重组酶聚合酶扩增技术通过模拟DNA体内扩增，在等温条件下产生目的片段，该技术主要依赖重组酶UvsX、单链结合蛋白Gp32和链置换DNA聚合酶Bsu。重组酶UvsX能够不通过加热就解开双链DNA。重组酶聚合酶扩增反应开始时，重组酶UvsX在ATP的参与下结合引物，形成核酸蛋白复合体，这些复合体能够扫描与引物序列互补的目标双链DNA。接着，核酸蛋白复合体侵入5'端位点形成D状环。单链结合蛋白Gp32与被置换单链结合使其稳定。同时，重组酶UvsX离开寡核苷酸的3’端，降解后被DNA聚合酶利用。之后，链置换DNA聚合酶Bsu结合在核酸蛋白复合体的游离3'端，进行链延伸，形成新的互补链。在链延伸的过程中，新合成的单链与原始互补链配对。以上步骤循环进行，实现DNA的指数增长。重组酶聚合酶扩增技术是一项由多种酶和蛋白参与，在恒定温度条件下实现核酸指数扩增的新技术，具有反应灵敏、高效、性价比高的特点。重组酶聚合酶扩增技术中重组酶UvsX具有重要作用，但目前能够获得的重组酶UvsX的纯度最高只能够达到50％，而且uvsX基因在基因工程菌中的表达量低，量产化成本高。
技术实现思路
基于此，有必要针对重组酶UvsX的纯度偏低且量少的问题，提供一种重组酶UvsX的制备方法、表达基因及重组表达载体。一种重组酶UvsX的表达基因，包括如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。上述表达基因，编码的重组酶uvsX基因能够在大肠杆菌中实现大量可溶性表达，且表达的重组酶UvsX的纯度大于95％。一种重组表达载体，包括pET-28a载体和插入在所述pET-28a载体中的目的基因表达片段，所述pET-28a载体包括pET-28a载体的基本序列、多克隆位点序列、启动子序列，所述多克隆位点包括BamHI酶切位点和SalI酶切位点，所述目的基因表达片段中含如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，所述目的基因表达片段的5’端具有BamHI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’端具有SalI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段正向插入在所述多克隆位点序列的所述BamHI酶切位点和所述SalI酶切位点之间。一种重组酶UvsX的制备方法，包括以下步骤：将目的基因表达片段导入pET-28a载体中，得到重组表达载体，所述目的基因表达片段含有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，所述目的基因表达片段的5’端具有BamHI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’端具有SalI酶切位点黏性末端；将所述重组表达载体转入大肠杆菌，得到重组工程菌；以及对所述重组工程菌进行诱导培养，得到所述重组酶UvsX。在其中一个实施例中，在将目的基因表达片段导入pET-28a载体中得到重组表达载体的步骤之前，还包括以下步骤：以如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，所述上游引物包括BamHI酶切位点，所述下游引物包括SalI酶切位点；将所述PCR扩增产物插入到pMD19-TSimple载体，并转化至感受态细胞中，得到克隆载体；以及用限制性内切酶BamHI和限制性内切酶SalI对所述克隆载体进行双酶切，得到目的基因表达片段。在其中一个实施例中，所述上游引物的碱基序列如SEQIDNo.2所示，所述下游引物的碱基序列如SEQIDNo.3所示。在其中一个实施例中，所述大肠杆菌为BL21(DE3)。在其中一个实施例中，所述对所述重组工程菌进行诱导培养得到所述重组酶UvsX的步骤中，包括：在重组工程菌的菌落OD值为为0.4～0.8时，加入终浓度为0.05mM/L～0.15mM/L的异丙基硫代半乳糖苷，并在19℃～25℃诱导表达20h～24h，固液分离收集上清，得到粗产物；以及将所述粗产物纯化，得到所述重组酶UvsX。在其中一个实施例中，所述将所述粗产物纯化得到所述重组酶UvsX的步骤中，包括：将所述粗产物采用硫酸铵盐析后进行Ni亲和纯化，得到所述重组酶UvsX。一种重组酶UvsX，其特征在于，通过如权利要求3～8任一项所述的重组酶UvsX的制备方法获得。上述重组酶UvsX能够不通过加热就解开双链DNA，纯度大于95％。上述重组酶UvsX在重组酶聚合酶扩增领域的应用。上述重组酶UvsX作为重组酶聚合酶扩增领域中的一种重要酶，在恒定温度条件下可与重组酶聚合酶扩增领域的其他酶和蛋白一起实现核酸指数扩增，重组酶UvsX的应用可以使得DNA的扩增反应灵敏、高效、性价比高。附图说明图1为实施例1的克隆载体的部分正向测序图；图2为实施例1的克隆载体的另一部分正向测序图；图3为实施例1的克隆载体的部分反向测序图；图4为实施例1的克隆载体的另一部分反向测序图；图5为实施例1的克隆载体的另一部分反向测序图；图6为实施例1的重组工程菌的平板培养物与阴性对照及阳性对照对比图；图7为实施例1的重组工程菌的菌落PCR电泳图；图8为实施例1的重组工程菌诱导后菌体的SDS-PAGE电泳图；图9为实施例1的重组工程菌诱导后菌体、诱导且超声破碎后离心上清及诱导且超声破碎后离心沉淀的SDS-PAGE电泳图；图10为实施例1的重组工程菌诱导后超声破碎的上清在Ni柱纯化前后的SDS-PAGE电泳结果比对图；图11为实施例1的重组酶UvsX酶活性验证的电泳图。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的部分实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本专利技术公开内容更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。一实施方式的重组酶UvsX的制备方法，包括以下步骤：S110、以如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，上游引物包括BamHI酶切位点，下游引物包括SalI酶切位点。具体地，步骤S110具体包括以下步骤S111～S113：S111、获得重组酶UvsX的基因编码序列。具体地，重组酶UvsX的基因编码序列可以从基因数据中筛选获得。S112、重新设计编码重组酶UvsX的核苷酸序列，得到如SEQIDNo.1序列。在本实施方式中，选取埃希氏杆菌属T4病毒(EscherichiavirusT4)编码重组酶UvsX的基因序列，并对该基因序列根据大肠杆菌密码本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组酶UvsX的表达基因，其特征在于，包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种重组酶UvsX的表达基因，其特征在于，包括如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。2.一种重组表达载体，其特征在于，包括pET-28a载体和插入在所述pET-28a载体中的目的基因表达片段，所述pET-28a载体包括pET-28a载体的基本序列、多克隆位点序列、启动子序列，所述多克隆位点包括BamHI酶切位点和SalI酶切位点，所述目的基因表达片段中含如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，所述目的基因表达片段的5’端具有BamHI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’端具有SalI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段正向插入在所述多克隆位点序列的所述BamHI酶切位点和所述SalI酶切位点之间。3.一种重组酶UvsX的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将目的基因表达片段导入pET-28a载体中，得到重组表达载体，所述目的基因表达片段含有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，所述目的基因表达片段的5’端具有BamHI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’端具有SalI酶切位点黏性末端；将所述重组表达载体转入大肠杆菌，得到重组工程菌；以及对所述重组工程菌进行诱导培养，得到所述重组酶UvsX。4.如权利要求3所述的重组酶UvsX的制备方法，其特征在于，在将目的基因表达片段导入pET-28a载体中得到重组表达载体的步骤之前，还包括以下步骤：以如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行P...

【专利技术属性】
技术研发人员：周娇娇，李泓彦，莫颜瑛，张敏，
申请(专利权)人：深圳市艾伟迪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44