STAT3在猪卵巢颗粒细胞中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种STAT3在猪卵巢颗粒细胞中的应用。本发明专利技术以STAT3为研究对象，通过构建猪STAT3基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒，并通过其在猪卵巢颗粒细胞的表达活性找到STAT3的核心启动子区；再验证转录因子C/EBPβ与STAT3核心启动子区之间的相互作用；随后构建C/EBPβ超表达载体和合成小干扰RNA(C/EBPβ‑siRNA)，检测C/EBPβ对STAT3的影响；最后分别转染C/EBPβ超表达载体和C/EBPβ‑siRNA到颗粒细胞检测细胞的凋亡和增殖。本发明专利技术通过找到STAT3启动子区结合的转录因子C/EBPβ在卵巢颗粒细胞中的应用，对于研究卵巢卵泡闭锁机制具有很好的应用价值。

Application of STAT3 in porcine ovarian granulosa cells *

【技术实现步骤摘要】
STAT3在猪卵巢颗粒细胞中的应用
本专利技术属于细胞工程和基因工程
，特别涉及一种STAT3在猪卵巢颗粒细胞中的应用。
技术介绍
卵巢是决定雌性动物繁殖力的重要器官，它的主要功能之一就是卵泡发育和排卵。卵巢功能异常会导致生殖降低，这些功能异常情况包括卵巢早衰(Prematureovarianfailure，POF)、多囊卵巢综合症(polycysticovariansyndrome，PCOS)以及卵巢癌症等。其中卵巢早衰的主要原因：一是在胚胎时期没有形成足够多的原始卵泡(先天不足)；二是原始卵泡的激活和抑制受到影响，也有研究显示卵泡闭锁的加速也能引发卵巢早衰。在卵泡的发育过程中，颗粒细胞会由扁平状变成立方形进而分化，这一系列的变化都会对卵母细胞的成长发育、原始卵泡生长的启动、生长期卵泡发育的调控以及卵泡闭锁有着重要的作用。此外颗粒细胞凋亡也是启动卵泡闭锁的重要机制。STAT3(Thesignaltransducerandactivatoroftranscription3)蛋白作为STAT家族的一员，在不同种类的细胞中有着多种生物学功能包括细胞增殖、分化以及凋亡等。研究显示，STAT3基因在心、肺、肾、卵巢、输卵管和子宫组织中都有表达，特别是在生殖系统组织中有相对高的表达。此外，在卵母细胞、颗粒细胞、膜细胞以及间质细胞中都检测到了高水平的STAT3和蛋白。STAT3通路是由几种配体激活比如瘦素和白介素6，在小鼠中，激活的STAT3(磷酸化的STAT3，pSTAT3)参与了由凋亡引起的乳腺退化生理过程。另有研究显示，在牛卵泡闭锁过程中STAT3被激活。瘦素调节猪卵巢颗粒细胞的类固醇生成，同时在细胞培养基中添加瘦素会增加磷酸化STAT3的水平。表皮生长因子是颗粒细胞功能的调控者，STAT3由EGF激活后，从颗粒细胞的胞质转移到核内。目前研究中只在细胞和组织水平上进行了验证，没有在活体猪上进行验证，主要原因是动物某种表型的变化是由多种因素引起的，另外，在没有较高把握成功的实验情况下，猪活体实验成本也高。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种STAT3在猪卵巢颗粒细胞中的应用。本专利技术的另一目的在于提供C/EBPβ在调控STAT3基因转录中的应用。本专利技术的再一目的在于提供抑制C/EBPβ的RNA小干扰片段(siRNA)。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：STAT3在猪卵巢颗粒细胞中的应用。C/EBPβ在调控STAT3基因转录中的应用，转录因子C/EBPβ促进STAT3核心启动子的转录活性。本专利技术提供抑制C/EBPβ的siRNA，序列如下：siRNA-C/EBPβ-1：5′-CCATGGAAGTGGCCAACTT-3′；siRNA-C/EBPβ-2：5′-CCTCGCAGGTCAAGAGTAA-3′；siRNA-C/EBPβ-3：5′-GGAACTTGTTCAAGCAGCT-3′；转录因子C/EBPβ促进STAT3基因的转录和蛋白合成，siRNA-C/EBPβ抑制STAT3基因的转录和蛋白合成。C/EBPβ在抑制猪卵巢颗粒细胞凋亡、和/或促进猪卵巢颗粒细胞增殖中的应用。本专利技术的验证结果如下：1、将Stat3基因启动子缺失片段重组质粒和pGL-TK内参质粒依次共转染到卵巢颗粒细胞。多功能酶标仪测量萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的具体数值，计算其对应比值，即为各重组质粒活性。Stat3基因5’调控区各缺失片段活性值如图所示。由图结果可知，P3(-1034/+375)的活性显著低于P2(-1532/+375)和P4(-587/+375)，且差异极显著(P＝0.000178和P＝0.000964)。当缺失-1532/-1034片段后，活性显著下降，由此我们可知-1532/-1034片段存在正向调控元件的结合位点。当缺失-1034/-587片段后，活性显著上升，由此我们可知-1034/-587片段存在反向调控元件的结合位点。综上，-1532/-587片段为Stat3基因启动子核心调控区。2、首先我们用TFBIND、JASPAR、Bimas等一些生物信息学网站预测-1532/-1034区域的转录因子，再通过ChIP验证。我们主要关注了C/EBPβ这个转录因子。ChIP结果显示，实验组Ip和Input组都有条带且亮度基本一致，阳性对照组H3有条带但阴性对照组IgG组无条带。综上，C/EBPβ通过识别结合在STAT3启动子区的-1397/-1387区域。3、合成3对干扰C/EBPβ小片段/对照(C/EBPβ-siRNA/siRNA-NC)，筛选并检测其干扰效率。由附图结果可知，转染基因干扰小片段到颗粒细胞中，通过qRT-PCR手段，最终筛选干扰效果较好的C/EBPβ-siRNA-2小片段进行后续实验。siRNA-C/EBPβ-1：5′-CCATGGAAGTGGCCAACTT-3′；siRNA-C/EBPβ-2：5′-CCTCGCAGGTCAAGAGTAA-3′；siRNA-C/EBPβ-3：5′-GGAACTTGTTCAAGCAGCT-3′。4、为了研究C/EBPβ对STAT3基因表达的影响，首先我们将STAT3正向调控区的重组质粒P2(-1532/+375)分别与C/EBPβ超表达载体(pcDNA3.1-C/EBPβ)或小干扰RNA(C/EBPβ-siRNA)共转染到颗粒细胞，来探索C/EBPβ对STAT3核心启动子区转录活性的影响。接着我们分别转染pcDNA3.1-C/EBPβ或C/EBPβ-siRNA到颗粒细胞，利用Q-PCR和WB来分析C/EBPβ在转录和翻译水平上对STAT3基因表达的影响。结果显示pcDNA3.1-C/EBPβ组的荧光活性显著高于对照组pcDNA3.1，C/EBPβ-siRNA组的荧光活性显著低于对照组siRNA-NC。这表明C/EBPβ促进STAT3核心启动子的转录活性，C/EBPβ-siRNA抑制转录活性。另一部分结果显示pcDNA3.1-C/EBPβ组的STAT3mRNA和蛋白水平显著高于对照组pcDNA3.1，C/EBPβ-siRNA组的STAT3mRNA和蛋白水平显著低于对照组siRNA-NC。这表明C/EBPβ促进STAT3基因的转录和蛋白合成，C/EBPβ-siRNA抑制STAT3基因的转录和蛋白合成。5、我们分别转染pcDNA3.1-C/EBPβ或C/EBPβ-siRNA到颗粒细胞，利用AnnexinV-FITC法和Edu法分别检测C/EBPβ对颗粒细胞凋亡和增殖的影响。结果显示pcDNA3.1-C/EBPβ组的凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)显著低于对照组pcDNA3.1，C/EBPβ-siRNA组的凋亡率显著高于对照组siRNA-NC。另一部分结果显示pcDNA3.1-C/EBPβ组的增值率显著高于对照组pcDNA3.1，C/EBPβ-siRNA组的增殖率显著低于对照组siRNA-NC。综上，C/EBPβ可能抑制卵巢颗粒细胞的凋亡和促进增殖。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：1、本专利技术是首次证实转录因子C/EBPβ对STAT3基因转录调控的影响：通过双荧光素酶报告系统找到STAT3基因的核心启动子区，进而利用染色质免疫沉淀技术(ChIP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.STAT3在猪卵巢颗粒细胞中的应用。

【技术特征摘要】
1.STAT3在猪卵巢颗粒细胞中的应用。2.C/EBPβ在调控STAT3基因转录中的应用。3.根据权利要2所述的C/EBPβ在调控STAT3基因转录中的应用，其特征在于，抑制C/EBPβ的siRNA，序列如下：siRNA-C/EBPβ-1：5′-CCATGGAAGTGGCCAACTT-3′。4.根据权利要2所述的C/EBPβ在调控STAT3基因转录中的应用，其特征在于，抑制C/EBPβ...

【专利技术属性】
技术研发人员：张哲，袁晓龙，李加琪，周小枫，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44