一种能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因即MSTN突变基因。所述MSTN突变基因是在MSTN基因第一内含子上敲除几个碱基序列。该MSTN突变基因能够促进牛骨骼肌产生双肌现象。还公开了该MSTN突变基因的应用。

A partial deletion of myostatin gene expressed in cattle and its application

The invention discloses a myostatin gene, namely MSTN mutant gene, which can be expressed in bovine with partial base deletion. The MSTN mutant gene knockout several base sequences on the first intron of MSTN gene. The MSTN mutant gene can promote the double muscle phenomenon of bovine skeletal muscle. The application of the MSTN mutant gene is also disclosed.

【技术实现步骤摘要】
一种能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因及其应用
本专利技术涉及生物
中的基因工程技术，具体涉及一种肌肉抑制素基因密码子及其应用，更具体涉及一种能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因(即MSTN突变基因)及其应用。
技术介绍
MSTN是一种肌肉抑制素基因，属于TGF-β超家族，它的合成主要是由骨骼肌完成，属于多肽中的分泌型，作为TGF-β超家族的成员，它具有与这个家族共同的生物结构：包括位于N-末端的分泌信号肽、蛋白酶水解位点(proteolyticprocessingsite，RSRR)和位于C-末端的成熟肽区，含有半胱氨酸(cystineknot)结构，这些组件组成一个52kDa的没有活性的前体蛋白，通过中间的蛋白水解位点的加工后才可形成一个26kDa的活性肽，从而发挥该有的生物功能。MSTN基因cDNA的组成：1个可读框(ORF)、3个外显子、2个内含子的核苷酸序列。1997年Mcpherron等人在筛选小鼠的肌肉cDNA文库首次发现myostatin(MSTN)基因，同年Grobet等人对自然双肌的比利时兰牛进行了测序，结果发现比利时蓝牛MSTN的p.D273RfsX13发生了纯合突变，从而引起双肌性状。1999年，Carlson等人也发现若大量的MSTN存在于骨骼肌中会使得肌肉生长受到抑制，形成肌肉萎缩，同时Lee等人则发现该基因由特定的肌肉组织产生，调节肌肉组织的生长，该基因缺失后，会使一些动物出现双肌现状。此后，人们开展了一系列与MSTN相关的研究，发现MSTN突变小鼠除了出现双肌性状，还可以以肌肉再生增强以及纤维化程度降低的方式提高肌肉愈伤能力；糖的消耗和糖摄入加强，对胰岛素的敏感性加强；心脏增大且压力应激增强；脂肪含量减少，脂肪的发生也会受到抑制，且白色脂肪向棕色脂肪转变加强从而促进机体的生热作用；骨密度、骨矿物质含量也会有所增强，同时还可以可增加骨痂、骨折的尺寸和强度而加快骨折后的愈合。通过调控胎盘的建立和葡萄糖的摄入，以此来调控子宫平滑肌细胞和内膜上皮细胞的增殖及乳腺的发育，参与雌性哺乳动物的生殖调控。CN102653764B公开了一种在牛MSTN基因中引入移码突变的方法，其构建了一个牛MSTN基因移码突变的打靶载体，通过同源重组将移码突变引入牛MSTN基因第3外显子；首先合成出包含移码突变的MSTN同源短臂，使其在第3外显子上缺失11bp，形成移码突变；然后合成MSTN的同源长臂，利用酶切位点插入载体pFPC-1，构建出牛MSTN基因移码突变的打靶载体pFPC-MSTN，得到的打靶载体线性化后转染牛体细胞，通过同源重组在牛MSTN基因中引入移码突变，利用这种细胞可以在生产中得到MSTN基因移码突变的转基因牛，从而提高其产肉性状，提高牛肉的品质与产量。CN103088044B公开了一种敲除牛肌肉生长抑制素MSTN基因的启动子捕获型打靶载体，其为PIIIMSTN，包含MSTN基因上下游同源臂3’同源臂和5’同源臂，所述5’同源臂的最后一个碱基为MSTN第一外显子起始密码子上游最后一个碱基，在同源臂之间还具有标记基因；所述5’同源臂核苷酸序列如SEQIDNO：1的8824～10133；3’同源臂核苷酸序列如SEQIDNO：1的15091～21957；所述标记基因包括报告基因EGFP和带有启动子PGK的新霉素抗性选择基因Neor；该打靶载体的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。CN106119283A公开了一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除MSTN基因的方法，该方法通过对多物种进行同源对比选取两对MSTN基因靶序列，利用gRNA的PAM设计原则，合成两对靶序列不同，表达的蛋白相同，带有相同BsmBI粘性末端的DNA双链，将双链与pPDNA330质粒进行连接得到携带有多物种的MSTN同源基因的重组载体，重组载体利用荧光蛋白表达法对基因敲除效率进行检测，选择敲除效率更高的载体转染多物种受体细胞，进行基因敲除并验证。CN102260711B公开了一种利用锌指核酸酶敲除牛肌肉抑制素基因的方法，其是根据牛肌肉抑制素基因序列，设计ZFNs特异位点表达载体并转入牛的成纤维细胞中，获得肌肉抑制素基因敲除的细胞，该方法设计特异的锌指结合蛋白酶ZFNs，其作用的DNA序列为：ZFNs-Setl：GTCATTACCATGCCCACGGAGTGTGAGTAGTCCTGCTGGT；包括如下步骤：1)构建MSTN-ZFN-Set1-pZFN1和MSTN-ZFN-Setl-pZFN2表达载体，它们的碱基序列分别如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；2)将上述表达载体分别转入牛的成纤维细胞中，通过PCR产物测序检测肌肉抑制素基因发生敲除的细胞。CN105671080A公开了CRISPER-Cas9系统介导的羊MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法，该方法是根据羊的MSTN基因序列，构建基于CRISPER-Cas9系统的gRNA表达载体，并根据gRNA作用位点构建含有外源基因的且可以整合至宿主基因组中的供体质粒，然后将优化的CRISPER-Cas9载体、上述构建的gRNA表达载体和线性化的供体质粒共同转入羊的成纤维细胞中，获得羊MSTN基因敲除且定点整合外源基因的细胞。US444745A公开了一种能在转移基因牛中产生重组多肽的转移基因，包括能在至少一种所述牛的细胞类型中通过操作与编码重组多肽的重组DNA连接的至少一种表达调控DNA顺序，其中所述转移基因能使所述重组DNA顺序在至少所述一种含有该转移基因的牛细胞类型中进行表达，产生所述重组多肽。“牛肌肉生长抑制素(MSTN)基因的检测、分型研究”，孙少华等，中国农业科技导报，2001，3(6)：66-67，该研究根据皮埃蒙特牛肌肉生长抑制素(MSTN)基因序列设计了3条特异性引物，以纯种皮埃蒙特牛、皮荷杂种牛和荷斯坦牛的DNA为模板，对是否携带MSTN基因的个体牛进行单核苷酸多态性分析，提出了一套牛肌肉生长抑制素基因检测分析以及准确鉴定其基因型的方法。以上研究说明，肌肉抑制素突变基因在动物体内是可以发挥肌肉含量增加的功效，而且没有表现出影响机体正常生理功能的征兆。然而，在动物体上自然突变的MSTN很少，因此如何对小鼠原有MSTN基因进行碱基敲除，使得其能够在哺乳动物中发挥作用是本领域亟待解决的技术问题，在进行gRNA优化过程中面临诸多挑战：首先是如何获得能够表达的基因序列，其次，还要构建打靶载体，考虑到打靶载体的打靶效率，外源基因mRNA的稳定性和mRNA二级结构对翻译效率的影响，优化的同时一定要避免阻碍表达的特殊的mRNA的二级结构的形成。上述挑战阻碍了对基因序列的优化。目前需要一种能够更有效地使小牛的肌肉量明显增大、体重显著增加、生化检测未发现健康异常的基因、更高效且低成本地获得该基因的方法及其应用。
技术实现思路
为了同时克服上述缺陷，本专利技术人经过深入研究和大量试验，提供了一种能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因及其获得方法和应用。为此，在本专利技术的一方面，提供了一种能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因，所述基因包含两个内含子和三个外显子序列，第一内含子上有部分碱基缺失。在本专利技术的另一方面，还提供了一种含本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因，所述基因包含两个内含子和三个外显子序列，第一内含子上有部分碱基缺失。

【技术特征摘要】
1.一种能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因，所述基因包含两个内含子和三个外显子序列，第一内含子上有部分碱基缺失。2.一种含有根据权利要求1所述的肌肉抑制素基因的序列的切割载体。3.根据权利要求2所述的载体在制备转基因牛或MSTN生物体性状研究中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其中所述载体用...

【专利技术属性】
技术研发人员：李光鹏，魏著英，白春玲，高洋，陈晨，王东，佟彬，张立，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15