一种CD4阳性细胞特异的DNA核酸适体及其嵌合体制造技术

技术编号:19002378 阅读:72 留言:0更新日期:2018-09-22 05:57
本发明专利技术公开了一种CD4阳性细胞特异的DNA核酸适体及其嵌合体。本发明专利技术结合具有细胞导向功能的核酸适体技术和RNAi技术,构建CD4阳性细胞特异的DNA核酸适体,以携带抗癌的siRNA选择性导入CD4阳性的肿瘤相关巨噬细胞。在体外肿瘤相关巨噬细胞和乳腺癌细胞培养系统中检测CD4阳性细胞特异的DNA核酸适体作为载体导向工具输送抗癌siRNA的功能和抗瘤效应。本发明专利技术基于导向性RNAi的新型基因抗癌药物,同时为RNAi靶向导入目标细胞的研发提供新思路。

A CD4 positive cell specific DNA aptamer and chimera

The invention discloses a CD4 positive cell specific DNA aptamer and its chimera. The present invention combines cell-directed aptamer technology with RNA technology to construct CD4-positive cell-specific aptamer DNA for selectively transfecting CD4-positive tumor-related macrophages with anti-cancer siRNA. The function and antitumor effect of CD4-positive cell-specific DNA aptamers as vector-directed delivery tools of anti-cancer siRNA were detected in tumor-associated macrophages and breast cancer cell culture systems in vitro. The invention is a novel gene anticancer drug based on directed RNAi, and provides a new idea for the research and development of RNAi targeting into target cells.

【技术实现步骤摘要】
一种CD4阳性细胞特异的DNA核酸适体及其嵌合体
本专利技术属于生物
,具体地说,涉及一种DNA核酸适体。
技术介绍
我国乳腺癌的发病率有上升的趋势,特别是晚期转移乳腺癌的病例增多。目前治疗乳腺癌仍然是以手术为主的综合治疗。自从提出了“乳腺癌是全身性疾病”的概念以后,全身治疗的方案越来越受到重视。但是,已经发生全身转移的乳腺癌仍然属于难治之症,这些病例往往对多种化疗和放疗方案都不敏感,各种治疗手段除了稍能延长寿命,并没有突破性进展。分子靶向治疗应运而生。分子靶向治疗针对特定的肿瘤生发位点设计药物,能够直接找到肿瘤细胞发挥抗肿瘤效应,而不会对周围正常组织产生过多负荷,这种方式也逐渐成为抗肿瘤治疗的趋势,而治疗靶点的发现则是靶向治疗的首要解决问题。研究发现,在乳腺癌的微环境中,肿瘤相关巨噬细胞TAMs以及其分泌的细胞因子CCL18对肿瘤细胞的浸润转移有十分重要的作用。细胞因子CCL18是C-C膜体细胞因子受体家族的一员,TAMs分泌的CCL18因子可以通过激活PI3K/Akt通路诱导乳腺癌细胞的EMT从而促进乳腺癌细胞的侵袭与转移。研究发现肿瘤相关巨噬细胞与乳腺癌细胞之间存在一种正反馈作用,它表现在肿瘤相关巨噬细胞可以分泌CCL18诱导乳腺癌细胞发生上皮-间充质转化(EMT)、加强后者侵袭和远处转移的能力;而乳腺癌细胞则同时大量分泌GM-CSF促进肿瘤相关巨噬细胞继续分泌更多CCL18;这种正向促进作用可以通过抑制CCL18因子的分泌被打破。目前通过靶向治疗乳腺癌的途径主要有单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂以及RNA干预(RNAi)等。前者如单抗Trastuzumab,又称herceptin,数年来多个中心大宗病例的临床应用结果证明,Herceptin单药治疗能通过阻断受体蛋白起作用使Her2阳性的晚期乳腺癌病例进入临床缓解期,并维持18个月之久。但由于单抗只能阻断细胞表面已合成的蛋白而不能彻底阻止其合成,且HER-2蛋白的分布非完全特异性,Herceptin作为大分子化合物的使用也存在较多毒副作用,其作用不够特异、完全。因此,要进一步扩展治疗乳腺癌的临床成果,有必要发展毒性低,又能较广谱的针对多类型的乳腺癌的有效方法。其他如传统的反义基因方法由于抑制基因表达的效果较弱,因此不能满足临床应用的需求。RNA干预(RNAi)是抑制基因表达的强大武器。AndrewZ.Fire和CraigC.Mello两位科学家于1998年报道发现了核糖核酸干扰(RibonucleicAcidInterference,RNAi)现象,并于2006年获得诺贝尔医学奖。2001年,Tuchl等把长度约为19-23碱基对、人工合成的外源性(SmallInterferingRNA,siRNA)导入哺乳动物细胞内,能诱导出特异地抑制互补序列基因表达的RNAi效应。该报道发表后,掀起了研究RNAi的热潮。从此,siRNA不仅被用作探讨细胞基因功能的工具,而且更吸引人的是应用siRNA抑制致病基因的表达,开托出治疗各类疾病,特别是恶性肿瘤的新型基因药物。与传统的抑制基因表达工具反义寡核苷酸和核糖酶比较,siRNA沉默基因表达的效应要强大数十倍至数百倍,其抑制致病基因治疗疾病的潜力也远远大于传统的逆基因工具。因此,结合前述,CCL18基因的RNAi有希望突破以往反义寡核苷酸和核糖酶不尽人意的基因抑制效果,成为治疗乳腺癌的新型基因药物。在体外细胞培养或裸鼠移植肿瘤模型的实验中,有文献报道应用RNAi成功地抑制了癌基因如k-ras和cyclinE的表达,肿瘤抗凋亡基因BCL-2的表达和肿瘤耐药基因mdr1的表达,并有效地减少了癌细胞增殖,增加了其对化疗药物的敏感性。沉默Her2基因表达的RNAi也成功地抑制体外培养的乳腺癌细胞增殖。这些初步的实验充分证明了武装RNAi成为新一代抗肿瘤药物的潜力很大。但是,目前RNAi抗肿瘤的实验研究都是在体外培养的肿瘤细胞中直接转染或转导RNAi或在裸鼠移植肿瘤组织内直接注入RNAi,虽然这些实验获得一定的成功,但是距离在临床上真正使用RNAi治疗肿瘤还相差很远。目前,RNAi应用的主要障碍在于如何在临床应用时把特异的RNAi导入目标细胞胞浆内起作用,特别是导入过量表达目标基因的肿瘤细胞内。较常见的小分子RNA载体有:1.蛋白类主要包括抗体及其片段和短肽和多肽,如抗体偶联siRNA递送体统。偶联siRNA分子的蛋白分子如抗体在与细胞或靶器官表面抗原分子结合时进入细胞从而使siRNA发挥基因干扰作用。此递药系统的优势是通过抗原抗体分子结合的方式,具有结合特异性,但存在抗原非特异性,大分子蛋白在机体内的免疫原性及内环境屏障的透过率导致药物消耗及毒副反应,以及生产的特殊性导致费用高昂。2.纳米材料目前递药系统研究的一大热点即纳米材料,高分子纳米材料可通过物理化学性质被动或主动靶向肿瘤组织递送药物,相对蛋白类更容易穿过生理屏障被吸收,毒副作用相对较少,现也有研究可控释放的纳米材料,具有更安全可控的递药效果,但目前纳米材料的研究仍存在稳定因素及生物安全因素,且费用较高。3.核酸类主要指核酸适配体(aptamer),这是一类小片段的单链寡聚核苷酸,长度一般在200个碱基以内。Aptamer可通过自身的序列特点自然折叠形成的空间结构,从而与特定的分子具有高度的结合能力。这种核酸片段在自然界中存在,同时也可以通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)筛选得到。因其分子量很小,易通过结合靶蛋白内化进入细胞,这也使其具有双重作用,既可识别,还有协助药物内化,并且这类小分子核酸片段筛选出来后很容易得到,合成较简单快速,易于进行化学修饰和多功能化,组织穿透性好,免疫原性也更小,具有较少的毒副反应。目前核酸适配体的应用主要障碍是筛选得到具有靶蛋白特异结合的适配体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足,提供一种安全高效且具有特异结合CD4阳性肿瘤相关巨噬细胞和携带抗癌siRNA药物的核酸适体及其siRNA嵌合体。为了实现上述目的,本专利技术采用如下技术方案:一种CD4阳性细胞特异的DNA核酸适体,其核苷酸序列为TGACGTCCTTAGAATTGCGCATTCCTCACACAGGATCTT。如SEQNO.1所示。一种核酸适体-siRNA嵌合体,由上述的核酸适体与小分子RNA形成的核酸序列组合。所述小分子RNA为CCL18siRNA,其序列为:5′-ACAAGUUGGUACCAACAAATT-3′;如SEQNO.2所示。5′-UUUGUUGGUACCAACUUGUGC-3′;如SEQNO.3所示。本专利技术构建的能高效特异结合CD4阳性细胞的核酸适体的药物载体,同时具有靶向CD4阳性细胞和携带抗癌siRNA药物的双向功能。CD4核酸适配体aptamer和CCL18siRNA连接的嵌合体chimera的构建及其作为抗癌siRNA的药物载体的应用方案:1.构建以及验证CD4核酸适配体aptamer和CCL18siRNA连接的嵌合体chimera1.1CD4DNAaptamer,aptamer连接siRNA正义链的中间体以及siRNA反义链分别由公司(TAKARA,吉玛)合成提供。将相同浓度的中间体和siRNA反义链混合,加入退火缓冲液,本文档来自技高网
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一种CD4阳性细胞特异的DNA核酸适体及其嵌合体

【技术保护点】
1.一种CD4阳性细胞特异的DNA核酸适体,其特征在于,其核苷酸序列为TGACGTCCTTAGAATTGCGCATTCCTCACACAGGATCTT。

【技术特征摘要】
1.一种CD4阳性细胞特异的DNA核酸适体,其特征在于,其核苷酸序列为TGACGTCCTTAGAATTGCGCATTCCTCACACAGGATCTT。2.一种核酸适体-siRNA嵌合体,其特征在于,由权利要求1所述的核酸适体与小分子RNA形成的核酸序列组合。3.如权利要求2所述的核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员:姚燕丹宋尔卫张明霞李铨黄松音
申请(专利权)人:中山大学孙逸仙纪念医院
类型:发明
国别省市:广东,44

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