干扰长链非编码RNA PVT1表达的试剂在制备鼻咽癌放疗增敏剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种干扰长链非编码RNA PVT1表达的试剂在制备鼻咽癌放疗增敏剂中的应用。通过在鼻咽癌细胞系CNE2和5‑8F中导入靶向PVT1的干扰载体(siPVT1)抑制PVT1的表达后，细胞分别接受0，2，4，6，8Gy剂量的放射线照射，随后细胞继续培养12天，克隆集落形成实验表明与阴性对照(NC，转染scramble干扰载体的细胞)相比，抑制PVT1表达后，CNE2和5‑8F细胞形成的集落数明显减少，表明细胞对放射治疗更加敏感，表明干扰长链非编码RNA PVT1表达的试剂可以用于制备鼻咽癌放疗增敏剂。

Application of interfering reagent for long chain non coding RNA PVT1 expression in preparation of radiosensitizer for nasopharyngeal carcinoma

The invention discloses the application of a reagent interfering with the expression of long-chain non-coding RNA PVT1 in the preparation of radiosensitizer for nasopharyngeal carcinoma. After inhibiting the expression of PVT1 by introducing the interfering vector targeting PVT1 (siPVT1) into nasopharyngeal carcinoma cell lines CNE 2 and 5_8F, the cells were irradiated with 0,2,4,6,8 Gy of radiation respectively, and then cultured for 12 days. The clonal colony formation assay showed that compared with the negative control (NC, scramble interfering vector cells). After inhibiting the expression of PVT1, the number of colonies formed by CNE2 and 5_8F cells decreased significantly, indicating that the cells were more sensitive to radiotherapy, suggesting that the reagents interfering with the expression of long-chain non-coding RNA PVT1 could be used to prepare radiosensitizers for nasopharyngeal carcinoma.

【技术实现步骤摘要】
干扰长链非编码RNAPVT1表达的试剂在制备鼻咽癌放疗增敏剂中的应用
本专利技术属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及干扰长链非编码RNAPVT1表达的试剂在制备鼻咽癌放疗增敏剂中的应用方法。
技术介绍
人类基因组计划及其后续的DNA元件百科全书计划(TheEncyclopediaofDNAElementsProject,ENCODE)研究成果表明，蛋白编码基因序列仅占人类基因组序列的1-3％，而人基因组中绝大部分可转录的序列为长链非编码RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)。LncRNA广泛地存在于各种生物中，且随着生物复杂程度的升高，基因组中lncRNA序列的比例也相应地增大，提示lncRNA在生物进化过程中有重要意义。随着lncRNA不断被发现，它们的功能逐渐被诠释，科学家们发现lncRNA广泛而活跃地参与到生命活动不同层面的功能调控中，作为一个崭新的领域，已经成为国际生命科学研究领域新的前沿与热点。LncRNA可作为功能蛋白质的信号(signal)、诱导(guide)、诱饵(decoy)或支架(scaffold)分子等多种方式，在染色质重构、基因转录、翻译及蛋白修饰等多重水平调控基因的表达，并在包括发育、免疫、生殖等基本生理过程中扮演了不可替代的角色，更重要的是，lncRNA的表达与功能失调已经与包括恶性肿瘤在内的人类多种疾病紧密联系在了一起。因此，深入研究lncRNA的功能，揭示由lncRNA介导的遗传信息传递方式和表达调控网络，不仅可以从蛋白编码基因以外的角度重新注释和阐明基因组的结构与功能，深入发现生命活动的本质和规律，还有望从一个新的视角认识包括肿瘤在内的多种人类常见疾病的发病机理，并为这些疾病的诊断与治疗提供新的分子标志物与治疗靶点。鼻咽癌是常见高发的头颈部恶性肿瘤，容易发生颈部淋巴结转移，预后较差，放射治疗是目前鼻咽癌临床上主要的治疗方案，部分鼻咽癌患者由于癌细胞存在放射抵抗(Radioresistance)，也就是对放射治疗不敏感，放射线不能完全杀死肿瘤细胞，残存的肿瘤细胞最终复发，转移，导致患者的死亡。研究表明，这种肿瘤的发生发展是多基因参与、多步骤、多阶段的复杂过程，LncRNA在鼻咽癌的发生发展过程中可能也起到了重要的作用，同时lncRNA也可能参与了鼻咽癌细胞反射敏感性的调控。最近我们利用lncRNA芯片，构建了鼻咽癌活检组织及正常对照样品中lncRNA的表达谱，从中筛选了一些在鼻咽癌中差异表达的lncRNAs，经扩大样本实时荧光定量PCR验证，证实lncRNAPVT1在鼻咽癌中表达显著上调，表明针对该lncRNA的检测制剂可以用于鼻咽癌的辅助诊断。随后，我们进一步增加样本，在94例有临床随访资料的鼻咽癌石蜡存档标本中，通过原位杂交(insituhybridization)的方法检测了PVT1的表达水平，发现PVT1表达高的患者更容易发生放疗抵抗，其生存时间短于该lncRNA表达低的患者，因此针对该lncRNA的检测制剂也可以用于鼻咽癌的疗效预测和预后判断。我们通过设计并合成靶向PVT1的短发夹RNA(short-hairpinRNA,shRNAs)序列，构建了靶向PVT1的RNA干扰载体，转染到鼻咽癌细胞株中，并证实了靶向干扰PVT1的表达可明显增强鼻咽癌细胞的放疗敏感性。将PVT1的RNA干扰载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米基因转运体，多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒可保护PVT1的RNA干扰载体免受核酸酶降解，延长作用时间，且有更高的转染效率。因此针对该lncRNA的干扰制剂靶向抑制该lncRNA在鼻咽癌细胞中的表达可以诱导鼻咽癌细胞对放疗更加敏感，从而可以作为新型放疗增敏剂，用于鼻咽癌的辅助治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供干扰长链非编码RNAPVT1表达的试剂在制备鼻咽癌放疗增敏剂中的应用；该长链非编码RNA的序列如SEQNO:1所示。所述的干扰长链非编码RNAPVT1表达的试剂所需的3条干扰靶点序列如下：shRNA-1：GGACTTGAGAACTGTCCTTAshRNA-2：GCTTCTCCTGTTGCTGCTAGTshRNA-3：GCTCCACCCAGAAGCAATTCA。所述的干扰长链非编码RNAPVT1表达的试剂是利用干扰靶点序列制备的RNA干扰短发夹RNA表达载体。针对3条干扰靶点序列，以及载体，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形成两端分别带限制性酶切位点粘性末端的DNA双链；具体序列如下：shRNA-1：5’-GATCCCCGGACTTGAGAACTGTCCTTATTCAAGAGAGTAAGGACAGTTCTCAAGTCCTTTTTA-3’3’-GGGCCTGAACTCTTGACAGGAATGAAGTTCTCTCATTCCTGTCAAGAGTTCAGGAAAAATTCGA-5’shRNA-2：5’-GATCCCCGCTTCTCCTGTTGCTGCTAGTTTCAAGAGAACTAGCAGCAACAGGAGAAGCTTTTTA-3’3’-GGGCGAAGAGGACAACGACGATCAAAGTTCTCTTGATCGTCGTTGTCCTCTTCGAAAAATTCGA-5’shRNA-3：5’-GATCCCCGCTCCACCCAGAAGCAATTCATTCAAGAGATGAATTGCTTCTGGGTGGAGCTTTTTA-3’3’-GGGCGAGGTGGGTCTTCGTTAAGTAAGTTCTCTACTTAACGAAGACCCACCTCGAAAAATTCGA-5’。所述的用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体的制备方法具体如下：1)shRNA的设计首先根据长链非编码RNA基因PVT1，寻找shRNA靶点，3条靶点序列如下：shRNA-1：GGACTTGAGAACTGTCCTTAshRNA-2：GCTTCTCCTGTTGCTGCTAGTshRNA-3：GCTCCACCCAGAAGCAATTCA以广泛使用的在人类基因组中没有任何靶点的Scramble序列作为阴性对照，其序列如下：Scramble：GACACGCGACTTGTACCAC2)针对这3条靶点序列，及Scramble序列，以及OligoEngine公司pSUPER载体，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形成两端分别带限制性酶切位点BglII和HindIII粘性末端的DNA双链；具体需合成的各条寡核苷酸序列及它们配对退回后形成的DNA双链如下：shRNA-1：5’-GATCCCCGGACTTGAGAACTGTCCTTATTCAAGAGAGTAAGGACAGTTCTCAAGTCCTTTTTA-3’3’-GGGCCTGAACTCTTGACAGGAATGAAGTTCTCTCATTCCTGTCAAGAGTTCAGGAAAAATTCGA-5’shRNA-2：5’-GATCCCCGCTTCTCCTGTTGCTGCTAGTTTCAAGAGAACTAGCAGCAACAGGAGAAGCTTTTTA-3’3’-GGGCGAAGAGGACAACGACGATCAAAGTTCTCTTGATCGTCGTTGTCCTCTTCGAAAAATT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.干扰长链非编码RNA PVT1表达的试剂在制备鼻咽癌放疗增敏剂中的应用；该长链非编码RNA的序列如SEQ NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.干扰长链非编码RNAPVT1表达的试剂在制备鼻咽癌放疗增敏剂中的应用；该长链非编码RNA的序列如SEQNO:1所示。2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的干扰长链非编码RNAPVT1表达的试剂所需的3条干扰靶点序列如下：shRNA-1：GGACTTGAGAACTGTCCTTAshRNA-2：GCTTCTCCTGTTGCTGCTAGTshRNA-3：GCTCCACCCAGAAGCAATTCA。3.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，所述的干扰长链非编码RNAPVT1表达的试剂是利用干扰靶点序列制备的RNA干扰短发夹RNA表达载体。4.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，针对3条干扰靶点序列，以及载体，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形成两端分别带限制性酶切位点粘性末端的DNA双链；具体序列如下：shRNA-1：5’-GATCCCCGGACTTGAGAACTGTCCTTATTCAAGAGAGTAAGGACAGTTCTCAAGTCCTTTTTA-3’3’-GGGCCTGAACTCTTGACAGGAATGAAGTTCTCTCATTCCTGTCAAGAGTTCAGGAAAAATTCGA-5’shRNA-2：5’-GATCCCCGCTTCTCCTGTTGCTGCTAGTTTCAAGAGAACTAGCAGCAACAGGAGAAGCTTTTTA-3’3’-GGGCGAAGAGGACAACGACGATCAAAGTTCTCTTGATCGTCGTTGTCCTCTTCGAAAAATTCGA-5’shRNA-3：5’-GATCCCCGCTCCACCCAGAAGCAATTCATTCAAGAGATGAATTGCTTCTGGGTGGAGCTTTTTA-3’3’-GGGCGAGGTGGGTCTTCGTTAAGTAAGTTCTCTACTTAACGAAGACCCACCTCGAAAAATTCGA-5’。5.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，所述的用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体的制备方法具体如下：1)shRNA的设计首先根据长链非编码RNA基因PVT1，寻找shRNA靶点，3条靶点序列如下：shRNA-1：GGACTTGAGAACTGTCCTTAshRNA-2：GCTTCTCCTGTTGCTGCTAGTshRNA-3：GCTCCACCCAGAAGCAATTCA以广泛使用的在人类基因组中没有任何靶点的Scramble序列作为阴性对照，其序列如下：Scramble：GACACGCGACTTGTACCAC2)针对这3条靶点序列，及Scramble序列，以及OligoEngine公司pSUPER载体，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形成两端分别带限制性酶切位点BglII和HindIII粘性末端的DNA双链；具体需合成的各条寡核苷酸序列及它们配对退回后形成的DNA双链如下：shRNA-1：5’-GATCCCCGGACTTGAGAACTGTCCTTATTCAAGAGAGTAAGGACAGTTCTCAAGTCCTTTTTA-3’3’-GGGCCTGAACTCTTGACAGGAATGAAGTTCTCTCATTCCTGTCAAGAGTTCAGGAAAAATTCGA-5’shRNA-2：5’-GATCCCCGCTTCTC...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊炜，曾朝阳，李桂源，何奕，郭灿，熊芳，魏芳，唐艳艳，杨丽婷，王裕民，龚朝建，张姗姗，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43