一种改性硅藻土固定化醛缩酶的制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种改性硅藻土固定化醛缩酶的制备方法：包括以下步骤：1)取一定量的硅藻土，在400℃下焙烧2h，进行热活化，再在105℃下活化1h，干燥冷却后得到改性的硅藻土；2)将1)中得到的改性硅藻土用纯水洗涤后，放入1mol/L的氢氧化钠溶液中，50℃下孵育1h，超纯水清洗3次后，室温晾干；3)将纯化脱盐后的2‑脱氧‑d‑核糖‑5‑磷酸醛缩酶与2)中制备的改性硅藻土在室温下水浴中进行震荡后，抽滤，用石油醚清洗固定化载体3次，使载体颗粒均匀分散，抽真空干燥即得固定化醛缩酶。采用该改性硅藻土固定化醛缩酶为催化剂催化2‑脱氧‑D‑核糖‑5‑磷酸，得到3‑磷酸甘油醛和乙醛，催化活力显著提高，同时固定化后酶的重复利用能力显著提升。

Preparation and application of a modified diatomite immobilized aldolase

The invention discloses a preparation method of modified diatomite immobilized aldolase, which comprises the following steps: 1) taking a certain amount of diatomite, calcining it at 400 C for 2 hours, thermal activation, activation at 105 C for 1 h, drying and cooling to obtain modified diatomite; 2) washing the modified diatomite with pure water and putting it into 1 mol The modified diatomite prepared from 2 deoxyribose_5_phosphoaldolase and 2 deoxyribose820 The aldolase was immobilized by dispersing and vacuum drying. The modified diatomite immobilized aldolase was used as catalyst to catalyze 2 deoxyribose 5 phosphoric acid to obtain 3 phosphoglyceraldehyde and acetaldehyde. The catalytic activity of the immobilized aldolase was significantly improved, and the reuse ability of the immobilized enzyme was significantly enhanced.

【技术实现步骤摘要】
一种改性硅藻土固定化醛缩酶的制备方法与应用
本专利技术涉及通过固定化提高酶的催化活力及重复利用率的方法，具体涉及一种改性硅藻土固定化醛缩酶的制备方法与应用。
技术介绍
2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA,EC4.1.2.4)属于裂解酶(lyases)的一种，其可以有效地催化供体酮对受体醛的立体选择性加成反应生成C-C键，且反应可逆。由于反应在水溶液、中性pH下进行，无需基团保护，且在催化生成C-C键的同时，可形成两个手性中心，在手性合成方面，尤其是多羟基化合物制备中，比如在制备用于降血脂的他汀类药物中，具有较大的应用前景，因而引起了研究人员的广泛关注。相比其他生物酶催化剂，DERA能连续形成两个手性中心，减少了反应步骤，尤其在以乙醛作为供体的催化反应中，缩合得到的产物可以作为新的受体底物，继续缩合反应从而生成多个手性中心，用于多羟基化合物的制备，然而游离的DERA酶催化活力较低，且稳定性不佳，重复利用率差，导致催化效率达不到预期目标，这个瓶颈限制了DERA在工业生物催化领域中的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足和缺陷，提供一种改性硅藻土固定化醛缩酶的制备方法与应用。本专利技术采用以下技术方案：一种改性硅藻土固定化醛缩酶的制备方法，它的步骤如下：(1)取2.0g的硅藻土，在300-500℃下烘焙1-3h，进行热活化，再在100℃下活化1-2h，干燥冷却后得到改性硅藻土，备用。(2)取步骤(1)中得到的改性硅藻土用纯水洗涤后，放入1mol/L的氢氧化钠溶液中，40-80℃下孵育1h，超纯水清洗3次后，室温晾干，获得固定化载体。(3)配置1.0mg/ml的醛缩酶蛋白溶液，加入载体，醛缩酶蛋白与载体的质量比为1:25～1:100，室温下，pH调整至7.0，震荡1.0-4.0h后抽滤，用石油醚清洗固定化载体3次，使载体颗粒均匀分散，抽真空干燥即得改性硅藻土固定化醛缩酶。进一步地，所述的硅藻土中位粒径为22.2μm。进一步地，所述的焙烧温度为400℃，焙烧时间2.0h。进一步地，所述的热活化温度为100℃，活化时间为1.0h。进一步地，所述的孵育温度为50℃，活化时间为1.0h进一步地，所述的醛缩酶为来源于EscherichiacoliK12AB200068的2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶。改性硅藻土固定化醛缩酶在催化2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，以获得3-磷酸甘油醛和乙醛中的应用。具体为：将10mg固定化醛缩酶加入到1.0ml的50mM的三乙醇胺盐酸盐溶液中，25℃下反应。所述三乙醇胺盐酸盐溶液pH为7.5，含0.1mmol的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0.4mmol的底物2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml磷酸丙酮异构酶，11U/ml甘油磷酸脱氢酶。将离心回收得到的固定化醛缩酶，用pH7.0的磷酸缓冲溶液(50mM)清洗两次后抽滤，再用石油醚清洗固定化载体两次后，室温晾干，称量后加入到1.0ml的50mM的三乙醇胺盐酸盐溶液中，25℃下反应，测定其活力。所述三乙醇胺盐酸盐溶液pH为7.5，含0.1mmol的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0.4mmol的底物2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml磷酸丙酮异构酶，11U/ml甘油磷酸脱氢酶。本专利技术将改性硅藻土固定化醛缩酶用于催化2-脱氧-D-核糖-5-磷酸得到3-磷酸甘油醛和乙醛，其对底物的催化活力明显提高，同时简化了酶的回收和增加了重复利用次数，具有极大的工业应用前景。具体实施方式实施例1(1)用培养皿取2.0g的硅藻土，置于马弗炉中，在300℃下焙烧1.0h，进行热活化，再在100℃下活化1.0h，干燥冷却后得到改性硅藻土。(2)取步骤(1)中得到的改性硅藻土0.5g，用纯水洗涤后，放入1mol/L的氢氧化钠溶液中，40℃下孵育1h，超纯水清洗3次后，室温晾干，获得固定化载体。(3)配置1.0mg/ml的醛缩酶蛋白溶液(醛缩酶为来源于EscherichiacoliK12AB200068的2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶)，加入载体，醛缩酶蛋白与载体的质量比为1：25，室温下，pH调整至7.0，震荡1.0h后抽滤，用石油醚清洗固定化载体3次，使载体颗粒均匀分散，抽真空干燥即得改性硅藻土固定化醛缩酶，用Bradford法检测固定化反应剩余上清液中的蛋白浓度，载体的吸附量为22.1％。(4)将10mg固定化2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶加入到1.0ml的50mM的三乙醇胺盐酸盐溶液，三乙醇胺盐酸盐溶液的pH为7.5，含0.1mmol的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0.4mmol的底物2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml磷酸丙酮异构酶，11U/ml甘油磷酸脱氢酶，在25℃下反应后检测340nm处吸光度的变化。2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶的比活力为12.55U/mg。(5)离心回收得到改性硅藻土固定化醛缩酶，按照步骤4重复用于催化反应，重复第10次催化反应时，其比活力为初始值的50.1％，相同条件下未固定化的醛缩酶，重复第10次催化反应时，其比活力为初始值的10.9％。重复10次后，将离心回收得到的固定化醛缩酶，用pH7.0的磷酸缓冲溶液(50mM)清洗两次后抽滤，再用石油醚清洗固定化载体两次后，室温晾干，称量后加入到1.0ml的50mM的三乙醇胺盐酸盐溶液中，三乙醇胺盐酸盐溶液的pH为7.5，含0.1mmol的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0.4mmol的底物2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml磷酸丙酮异构酶，11U/ml甘油磷酸脱氢酶，在25℃下反应后检测340nm处吸光度的变化，固定化2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶的比活力为5.78U/mg。实施例2(1)用培养皿取2.0g的硅藻土(中位粒径为22.2μm)，置于马弗炉中，在500℃下焙烧3h，进行热活化，再在100℃下活化2h，干燥冷却后得到改性硅藻土。(2)取步骤(1)中得到的改性硅藻土0.5g，用纯水洗涤后，放入1mol/L的氢氧化钠溶液中，80℃下孵育1h，超纯水清洗3次后，室温晾干，获得固定化载体。(3)配置1.0mg/ml的醛缩酶蛋白溶液(醛缩酶为来源于EscherichiacoliK12AB200068的2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶)，加入载体，醛缩酶蛋白与载体的质量比为1：100，室温下，pH调整至7.0，震荡1.0h后抽滤，用石油醚清洗固定化载体3次，使载体颗粒均匀分散，抽真空干燥即得改性硅藻土固定化醛缩酶，用Bradford法检测固定化反应剩余上清液中的蛋白浓度，载体的吸附量为25.9％。(4)将10mg固定化2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶加入到1.0ml的50mM的三乙醇胺盐酸盐溶液，三乙醇胺盐酸盐溶液的pH为7.5，含0.1mmol的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0.4mmol的底物2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml磷酸丙酮异构酶，11U/ml甘油磷酸脱氢酶，在25℃下反应后检测340nm处吸光度的变化。2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶的比活力为8.67U/mg。(5)离心回收得到改性硅藻土固定化醛缩酶，按照步骤4重复用于催化反应，重复第10次催化反应时，其比活力为初始值的52.8％，相同条件下未固定化的醛缩酶，重复第10次催化反应时，其比活力为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种改性硅藻土固定化醛缩酶的制备方法，其特征在于，它的步骤如下：(1)取2.0g的硅藻土，在300‑500℃下焙烧1‑3h，进行热活化，再在100℃下活化1‑2h，干燥冷却后得到改性硅藻土。(2)取步骤(1)中得到的改性硅藻土用纯水洗涤后，放入1mol/L的氢氧化钠溶液中，40‑80℃下孵育1h，超纯水清洗3次后，室温晾干，得到固定化载体。(3)配置1.0mg/ml的醛缩酶蛋白溶液，加入步骤2制备的载体，醛缩酶蛋白与载体的质量比为1:25～1:100，室温下，pH调整至7.0，震荡1.0‑4.0h后抽滤，用石油醚清洗固定化载体3次，使载体颗粒均匀分散，抽真空干燥即得改性硅藻土固定化醛缩酶。

【技术特征摘要】
1.一种改性硅藻土固定化醛缩酶的制备方法，其特征在于，它的步骤如下：(1)取2.0g的硅藻土，在300-500℃下焙烧1-3h，进行热活化，再在100℃下活化1-2h，干燥冷却后得到改性硅藻土。(2)取步骤(1)中得到的改性硅藻土用纯水洗涤后，放入1mol/L的氢氧化钠溶液中，40-80℃下孵育1h，超纯水清洗3次后，室温晾干，得到固定化载体。(3)配置1.0mg/ml的醛缩酶蛋白溶液，加入步骤2制备的载体，醛缩酶蛋白与载体的质量比为1:25～1:100，室温下，pH调整至7.0，震荡1.0-4.0h后抽滤，用石油醚清洗固定化载体3次，使载体颗粒均匀分散，抽真空干燥即得改性硅藻土固定化醛缩酶。2.根据权利要求1所述的一种改性硅藻土固定化醛缩酶的制备方法，其特征在于，所述的硅藻土中位粒径为22.2μm。3.根据权利要求1所述的一种改性硅藻土固定化醛缩酶，其特征在于，所述的焙烧温度为400℃，焙烧时间2.0h。4.根据权利要求1所述的一种改性硅藻土固定化醛缩酶，其特征在于，所述的热活化温度为100℃，活化时间1.0h。5.根据权利要求1所述的一种改性硅藻土固定化醛缩酶，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：费辉，黄萌萌，孙聪，郑成才，陈雯琪，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33