重组安克洛酶及工业规模制备方法和治疗急性脑梗的应用技术

涉及重组安克洛酶及工业规模制备方法和治疗急性脑梗的应用。具体地，该重组安克洛酶具有说明书所示氨基酸序列单链，该安克洛酶是平均分子量39～41KDa、分子量范围33～52KDa、修饰糖含量>19％的糖蛋白。还涉及该重组安克洛酶的制备方法，细胞培养方法以及纯化方法和其治疗急性脑梗的应用。本发明专利技术重组安克洛酶呈现与天然安克洛酶显著更优异的性能。本发明专利技术方法能够以工业生产规格获得高表达量的重组安克洛酶，产量能够达到每毫升发酵液200IU/ml以上，比活性能够达到1000IU/mg。本发明专利技术重组安克洛酶具有更复杂和更完整的糖基化水平，稳定性显著增强，解决了安克洛酶表达量低、产业化困难的问题。

Recombinant aclolox enzyme and its industrial scale preparation and application in the treatment of acute cerebral infarction

It involves the application of recombinant aclolol enzyme and industrial scale preparation and treatment of acute cerebral infarction. Specifically, the recombinant anklorase has the single-stranded amino acid sequence shown in the instructions. The average molecular weight of the enzyme is 39-41 KDa, the molecular weight range is 33-52 KDa, and the modified sugar content is more than 19%. The preparation method, the cell culture method, the purification method and the application of the recombinant anklorase in the treatment of acute cerebral infarction are also involved. The recombinant recombinant enzyme has excellent performance compared with natural clenase. The method of the invention can obtain recombinant anklorase with high expression in industrial production specifications, the yield can reach over 200 IU/ml per milliliter fermentation broth, and the specific activity can reach 1000IU/mg. The recombinant anklorase of the invention has more complex and complete glycosylation level, remarkably enhanced stability, and solved the problems of low expression of anklorase and difficult industrialization.

【技术实现步骤摘要】
重组安克洛酶及工业规模制备方法和治疗急性脑梗的应用
本专利技术涉及一种重组安克洛酶、其制备方法及应用。更具体地，本专利技术涉及采用基因工程技术，利用哺乳动物CHO细胞培养生产方法制备重组蛋白，接着通过纯化工艺，可以容易的以工业生产规格获得高表达量的重组安克洛酶，产量能够达到每毫升发酵液200IU/ml以上，比活性能够达到1000IU/mg。本专利技术获得的重组安克洛酶具有更复杂和更完整的糖基化水平，稳定性显著增强，解决了现有该类产品表达量低、产业化困难的问题，本专利技术还涉及重组安克洛酶在治疗急性脑梗中的应用。
技术介绍
安克洛酶(Ancrod)特指从马来西亚红口蝮蛇(Malayanpitviper，Calloselasmarhodostoma)蛇毒中分离纯化出的类凝血酶，为丝氨酸蛋白水解酶。能够水解哺乳动物的血浆纤维蛋白原，使之转变为纤维蛋白，从而影响动物的出血凝血过程。蛇毒类凝血酶特异性作用底物是纤维蛋白原，与凝血酶不同的是，它只切割纤维蛋白原的α链，而不作用于β链。当它水解血浆纤维蛋白原α链中的Arg16-GLy位键时，能够释放出纤维蛋白肽A，从而快速地将血液中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，由于蛇毒类凝血酶不激活凝血因子ⅩⅢ，这些生成的纤维蛋白单体不交联形成坚固的纤维蛋白网状结构，易于被体内的纤维蛋白水解酶所水解，因此可以抑制血栓形成，具有降低血粘度、抑制红细胞凝集、沉降、增强红细胞的血管通过性及变形能力、降低血管阻力以及改善微循环等作用。使溶栓作用快速，缺血部位功能恢复，从而达到治疗和防止复发的效果。蛇毒类凝血酶制剂上市的品种有：来源于马来西亚红口蝮蛇蛇毒的安克洛酶(Ancrod，Viprinex，Arwin)；来源于巴西矛头蝮蛇(Bothropsmoojeni)蛇毒的巴曲酶(Batroxobin)；来源于尖吻蝮蛇(Agkistrodonacutus)蛇毒的降纤酶(Defibrase)。1985年至2000年，我国有不同蛇毒来源的含有蛇毒类凝血酶的多组分制剂流通，大多数称为蝮蛇抗栓酶。从1997年起，国产降纤酶替代了蝮蛇抗栓酶。天然的蛇毒类凝血酶均为糖蛋白，糖基化水平的高低与比活性成正相关，与活性稳定性成正相关。由于蝮蛇已经列入属国家二级濒危保护动物，天然蛇毒的资源极其有限，因此采用基因工程技术表达蛇毒类凝血酶具有现实意义。日本学者最早于1987年(J.Biol.Chem.262:3132-3135)将巴曲酶基因在大肠杆菌中表达成功，中国学者李招发等(中国专利授权公告号CN100564532C)在酵母菌中表达出生物活性高的巴曲酶蛋白，产量达到每毫升发酵液14巴曲酶单位(14BU/ml)，比活性为1400BU/mg。天然安克洛酶的氨基酸序列早在1992年由美国学者WilliamBurkhart等(WilliamBurkhart,etal,AminoacidsequencedeterminationofAncrod,thethrombin-likeα-fibrinogenasefromthevenomofAkistrodonrhodostoma，FederationofEuropeanBiochemicalSocieties，1992，Vol297(3):297-301)在其研究论文中进行了详细报道，其是一种含有234个氨基酸的糖蛋白。该蛋白的234个氨基酸序列已记载在该WilliamBurkhart的文献中，并且已收录在本领域公知的全球蛋白质资源库http://www.uniprot.org中，具体参见该库网址http://www.uniprot.org/uniprot/P26324所记载的信息。这种234个氨基酸组成的天然来源的安克洛酶Ancrod是从Akistrodonrhodostoma蛇毒中纯化得到的，由于众所周知的原因，例如蛇的生长环境、蛇龄、采毒季节等与蛇毒原材料变异有关的因素以及蛇毒中杂质等的影响和原材料产量的限制，对于以稳定的规模来工业化生产这种天然的安克洛酶以使其以安全、有效、可控的药剂顺利应用于临床是极端困难的。因此，本领域仍然期待有制备安克洛酶的方法，特别是以工业生产规模稳定的获得高表达量的安克洛酶特别是重组安克洛酶的方法。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种重组安克洛酶、制备方法及其应用，特别是提供一种以工业生产规模稳定的获得高表达量的重组安克洛酶的方法。该重组蛋白具有更复杂和更完整的糖基化水平，解决了现有该类产品表达量低产业化难的问题。本专利技术另一目的还在于提供一种重组安克洛酶在治疗急性脑梗中的应用。本专利技术的重组安克洛酶具有较强的体外活性和较高的稳定性。本专利技术的第一方面，提供了一种重组安克洛酶，该重组安克洛酶是由N-末端和C-末端氨基酸残基分别为缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的234个氨基酸残基组成的一条具有如下序列的单链：根据本专利技术第一方面的重组安克洛酶，其是一种平均分子量为39～41KDa的糖蛋白，包含的5个N-Link糖基化结合位点分别位于Asn23-Trp24-Thr25，Asn79-Lys80-Thr81，Asn99-Asn100-Ser101，Asn148-Phe149-Thr150和Asn229-Ala230-Thr231处的天冬酰胺残基上，且该糖蛋白的等电点为4.5-5.5。根据本专利技术第一方面的重组安克洛酶，其是一种分子量分布范围为33～52KDa的糖蛋白。根据本专利技术第一方面的重组安克洛酶，其是一种修饰糖含量为19～49％的糖蛋白。经细致分析测定，已经知晓连接于糖基化位点上的修饰糖包括半乳糖、海藻糖、唾液酸等数种，它们在氨基酸链上的结合方式显示呈多层天线状结构。需要说明的是，由234个氨基酸残基组成的安克洛酶单链的分子量为26570Da；本专利技术方法制备得到的重组安克洛酶糖蛋白，经液相色谱-质谱法(LC-MS)测定，其平均分子量为39～41kDa，分子量分布范围为33～52kDa(分布跨度达17kDa以上)。另外，本专利技术人参照WilliamBurkhart文献Fig.1之A之lane3所示天然安克洛酶糖蛋白的获取方法，采用马来西亚红口蝮蛇蛇毒为原料，获得天然糖基化蛋白即天然安克洛酶，经用本专利技术LC-MS法测定/计算，其平均分子量为37.5～38kDa，分子量分布范围为32～41kDa(分布跨度约9kDa)；该LC-MS测定结果与WilliamBurkhart文献所示结果有差异的原因在于采用的检测方法不同，文献方法是一种在当时技术条件下所能达到的相对准确的结果。由此，本专利技术制备得到的重组安克洛酶糖蛋白的234个氨基酸残基组成的安克洛酶单链与天然安克洛酶的氨基酸残基单链相同，但是由于其上连接的糖基化修饰糖不同(可能是接入糖的量以及接入的结构/方式不同造成)，本专利技术重组蛋白比之于天然蛋白具有更复杂和更完整的糖基化水平，能够呈现显著增强的稳定性以及生物学活性，因此本质上讲本专利技术所得重组安克洛酶完全区别于天然安克洛酶。安克洛酶糖基化的复杂性和完整性能够在糖蛋白的分子量及分布上反映出来：分子量越大，则糖基化程度越高、糖基化分支及侧链的复杂程度亦越高，相应的糖蛋白稳定性和生物学活性亦更高；而更高稳定性的糖蛋白使得以高产量、高表达量的工业规模和水平制备糖蛋白成为可能。在本专利技术中，如未特别本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组安克洛酶，该重组安克洛酶是由N‑末端和C‑末端氨基酸残基分别为缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的234个氨基酸残基组成的一条具有如下序列的单链：

【技术特征摘要】
1.一种重组安克洛酶，该重组安克洛酶是由N-末端和C-末端氨基酸残基分别为缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的234个氨基酸残基组成的一条具有如下序列的单链：2.根据权利要求的重组安克洛酶，其特征在于：其是一种平均分子量为39～41KDa的糖蛋白，包含的5个N-Link糖基化结合位点分别位于Asn23-Trp24-Thr25，Asn79-Lys80-Thr81，Asn99-Asn100-Ser101，Asn148-Phe149-Thr150和Asn229-Ala230-Thr231处的天冬酰胺残基上，且该糖蛋白的等电点为4.5-5.5；其是一种分子量分布范围为33～52KDa的糖蛋白；其是一种修饰糖含量为19～49％的糖蛋白；和/或经液相色谱-质谱法(LC-MS)测定，其平均分子量为39～41kDa，分子量分布范围为33～52kDa。3.制备重组安克洛酶的方法，该方法包括如下步骤：(1)构建编码重组安克洛酶的基因表达载体和重组质粒：构建用于在哺乳动物细胞中分泌性表达重组蛋白质的载体；(2)重组安克洛酶在哺乳动物宿主细胞中的稳定表达：将含有安克洛酶蛋白的表达载体转染到哺乳动物宿主细胞，筛选稳定表达目的蛋白的细胞株；(3)细胞培养生产重组安克洛酶：将筛选到的稳定细胞株转入反应罐进行大规模培养，当细胞密度达到最大时，收获培养物；(4)重组安克洛酶的纯化：(41)上层析柱前预处理：将上一步骤所得含有重组安克洛酶的培养液进行过滤去除细胞碎片，收集滤液，接着进行超滤浓缩，截留分子量30KDa膜板超滤至原体积的1/8～1/10；(42)亲和层析柱：采用亲和层析柱进行纯化纯化，使用盐浓度0.1～0.4mol/L的NaCl、0.05mol/L的Tris-HClpH7.0～7.5缓冲液的洗脱条件，洗脱并收集活性组分；(43)反相液相色谱纯化：采用制备型反相液相色谱技术，纯化上述得到的重组安克洛酶蛋白，利用极性大小的差别，采用乙醇-水系统梯度洗脱的方法，进一步去除其他杂质；(44)亲和柱层析：将上一步骤收集的重组蛋白采用亲和层析柱纯化，去除乙醇并实现重组蛋白的浓缩。4.根据权利要求3的方法，其中步骤(43)中，使用C4制备型色谱柱，采用下表所示梯度洗脱：时间/minAB0～5090→3010→7050～60307061.～719010其中流动相A为pH2.3的磷酸水溶液，流动相B为乙醇，检测波长为214nm，洗脱流速为20mL/min；在一个实施方案中，所述流动相A和流动相B中还均额外添加1％丙二醇。5.根据权利要求3的方法，其中：步骤(44)中的亲和柱层析与步骤(42)操作条件相同；步骤(1)中，构建编码重组安克洛酶的基因表达载体的步骤还包括：化学合成法完成安克洛酶糖蛋白的DNA编码序列，用T4DNA连接酶将此合成的DNA编码序列连接入ATK-V03-aSP载体，得到基因重组表达质粒ATK-V03-aSP-Ancrod，通过DNA测序进行验证重组质粒中插入序列的正确性；所述的哺乳动物细胞表达载体为ATK-V03-aSP；步骤(2)中所述转染的方法为细胞的电穿孔转染方法；所述的哺乳动物宿...

【专利技术属性】
技术研发人员：王增博，
申请(专利权)人：北京博康宁生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11