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一种植物RNA修饰和编辑的系统及方法技术方案

技术编号:19002356 阅读:241 留言:0更新日期:2018-09-22 05:56
本发明专利技术公开了一种植物RNA修饰和编辑的系统及方法,使用具有甲基转移酶的重组核酸酶dCas13a‑RsmB与dPspCas13b‑RsmB和具有腺嘌呤脱氨酶活性的重组核酸酶dPspCas13b‑hADAR(E488Q/T375G)对RNA进行胞嘧啶C甲基化修饰和腺嘌呤A到次黄嘌呤I的特异性转换,具有高效性和特异性等特点,是一种高效快速的RNA修饰和编辑系统。

A system and method for modifying and editing plant RNA

The present invention discloses a system and method for plant RNA modification and editing. RNA is modified by cytosine C methylation using recombinant nuclease dCas13a_RsmB with methyltransferase, dPspCas13b_RsmB with adenine deaminase and recombinant nuclease dPspCas13b_hADAR (E48Q/T5G) with adenine A to hypoxanthine I. Specific conversion, with high efficiency and specificity, is an efficient and rapid RNA modification and editing system.

【技术实现步骤摘要】
一种植物RNA修饰和编辑的系统及方法
本专利技术涉及基因工程
,尤其涉及一种植物RNA修饰和编辑的系统及方法,具体涉及使用具有甲基转移酶的重组核酸酶dCas13a-RsmB与dPspCas13b-RsmB和具有腺嘌呤脱氨酶活性的重组核酸酶dPspCas13b-hADAR(E488Q/T375G)对RNA进行胞嘧啶C甲基化修饰和腺嘌呤A到次黄嘌呤I的特异性转换。
技术介绍
在遗传学的研究过程中基因编辑工具的作用是非常重要的,近几年发现的CRISPR基因编辑技术以其特异性强、靶向性好、适用性广等特点成为广大科研工作者研究和开发的热点。利用CRISPR系统对基因组DNA进行敲除进而研究基因功能的方法是非常便利和高效的。CRISPR系统不仅能进行基因组DNA的敲除还可以通过融合突变的Cas蛋白序列与有催化功能的蛋白实现各种靶向基因编辑操作,如融合脱氨酶实现A-I和C-U的定点编辑。以上多种编辑修饰方式都是在DNA水平上进行的,而RNA作为重要的遗传信息传递介质对其的研究一直受到很大的限制,直到张峰在2016年发现沙氏纤毛菌(Leptotrichiashahii)中存在一种新型的CRISPR效应蛋白Cas13a(C2c2)。Cas13a具有RNA介导的RNA酶活性,这一发现为在RNA水平改变遗传信息提供了一种新的工具Abudayyeh,O.O.,J.S.Gootenberg,S.Konermann,J.Joung,I.M.Slaymaker,D.B.Cox,S.Shmakov,K.S.Makarova,E.Semenova,L.Minakhin,K.Severinov,A.Regev,E.S.Lander,E.V.KooninandF.Zhang(2016)."C2c2isasingle-componentprogrammableRNA-guidedRNA-targetingCRISPReffector."Science.)。2017年张峰教授又发现了PspCas13b,PspCas13b是一种比Cas13a更稳定更高效的核酸酶。PspCas13b不仅能进行RNA的切割还可以通过dPspCas13b(失活的PspCas13b)与不同功能的蛋白融合,实现各种靶向RNA的编辑,如通过融合hADAR在动物细胞中在RNA水平上实现A-I的定点编辑。但是目前该RNA编辑系统仅用于动物细胞中,其在植物系统中的RNA定点编辑效果还不知道。在植物体中RNA作为重要的遗传物质,截至目前已有100余种不同的化学修饰形式被发现。RNA甲基化(RNAmethylation)作为表观遗传学研究的重要内容之一,是指发生在RNA分子上不同位置的甲基化修饰现象,6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)和5-甲基胞嘧啶(C5-methylcytidine,m5C)是真核生物中最常见的两种RNA转录后修饰。RNA甲基化在调控基因表达、编辑、稳定性及降解等方面扮演重要角色。相对于DNA甲基化,RNA甲基化更加复杂,种类繁多,且普遍存在于各种高级生物中。迄今为止,还没有能够人为靶向修饰RNA的系统。因此,本领域急需一种高效快速的RNA编辑修饰系统。
技术实现思路
鉴于上述现有技术中存在的缺陷,本专利技术的目的是提出一种植物RNA修饰和编辑的系统及方法。为了实现上述目的,本专利技术采用了如下技术方案:一种植物RNA修饰和编辑的系统,包括靶向RNA的具有RNA修饰和编辑功能的重组核酸酶及其靶向RNA的gRNA。进一步的,所述重组核酸酶是将靶向RNA的无切割活性的核酸酶dCas13a(DeadCas13a,Cas13a也称为C2c2)和dPspCas13b分别与甲基转移酶结构域和腺嘌呤脱氨酶进行融合,形成的具有甲基转移酶活性的重组核酸酶dCas13a-RsmB与dPspCas13b-RsmB和具有腺嘌呤脱氨酶活性的重组核酸酶dPspCas13b-hADAR。一种植物RNA修饰和编辑的方法,应用所述的植物RNA修饰和编辑系统,将相应功能的酶引导到相应RNA上,实现植物RNA的修饰和编辑。进一步的,利用所述重组核酸酶在靶位点处进行胞嘧啶碱基的甲基化和腺嘌呤碱基的脱氨,最终实现植物RNA的m5C甲基化修饰和A转换为I。进一步的,所述植物RNA的修饰方法包括建立RNAm5C甲基化修饰的体外表达系统;所述体外表达系统利用原核表达系统进行体外蛋白的表达,获得带His和Msb标签的dCas13a-RsmB及dPspCas13b-RsmB的融合蛋白,并建立体外甲基化反应体系。进一步的,所述植物RNA的修饰方法包括建立RNAm5C甲基化修饰的体内表达系统;所述体内表达系统分别利用AtU6启动子驱动gRNA的表达,利用35S启动子驱动dCas13a-RsmB及dPspCas13b-RsmB的表达,在植物体内进行定点修饰实验。进一步的,所述植物RNA的编辑方法包括建立了提前翻译终止的dGFP的报告系统,用于其定点编辑的鉴定。进一步的,所述植物RNA的编辑方法为通过催化dGFP的RNA上的提前终止密码子TAG位点处的A碱基转换为了次黄嘌呤I,在翻译的过程中I将与C碱基配对,从而使终止密码子TAG恢复为TGG,GFP蛋白得以正常翻译;在植物体中进行瞬时表达,通过观察GFP的绿色荧光,来判断RNA定点编辑的效果。本专利技术的突出效果为:本专利技术的一种植物RNA修饰和编辑的系统及方法,使用具有甲基转移酶的重组核酸酶dCas13a-RsmB与dPspCas13b-RsmB和具有腺嘌呤脱氨酶活性的重组核酸酶dPspCas13b-hADAR(E488Q/T375G)对RNA进行胞嘧啶C甲基化修饰和腺嘌呤A到次黄嘌呤I的特异性转换,具有高效性和特异性等特点,是一种高效快速的RNA修饰和编辑系统。附图说明图1A为本专利技术实施例1的dCas13a-RsmB体外甲基化蛋白纯化所用载体和实施例2的拟南芥稳转的载体示意图;图1B为本专利技术实施例1的dCas13a-RsmB融合蛋白考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶图;图1C为本专利技术实施例1的dCas13a-RsmB体外甲基化结果图;图2A为本专利技术实施例2的拟南芥甲基转移酶TRM4B蛋白的保守结构域结构示意图;图2B为本专利技术实施例2的用于亚细胞定位的载体结构示意图;图2C为本专利技术实施例2的TRM4B亚细胞定位结果图;图3A为本专利技术实施例3dPspCas13b-RsmB体外甲基化蛋白纯化所用载体和用于拟南芥稳转的载体示意图;图3B为本专利技术实施例3的dPspCas13b-RsmB融合蛋白考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶图;图3C为本专利技术实施例3的dCas13b-RsmB体外甲基化结果图;图4为本专利技术实施例2的dCas13a-RsmB体内甲基化的靶位点序列及gRNA位置;图5为本专利技术实施例4的dPspCas13b-hADAR烟草RNAA到I碱基编辑的示意图;图6为本专利技术实施例5的dPspCas13b-hADAR拟南芥原生质体RNAA到I碱基编辑的示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图,对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例,而不是全部的实施例。本专利技术的一种植物RNA修饰和编辑的方本文档来自技高网
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一种植物RNA修饰和编辑的系统及方法

【技术保护点】
1.一种植物RNA修饰和编辑的系统,其特征在于:包括靶向RNA的具有RNA修饰和编辑功能的重组核酸酶及其靶向RNA的gRNA。

【技术特征摘要】
1.一种植物RNA修饰和编辑的系统,其特征在于:包括靶向RNA的具有RNA修饰和编辑功能的重组核酸酶及其靶向RNA的gRNA。2.根据权利要求1所述的一种植物RNA修饰和编辑的系统,其特征在于:所述重组核酸酶是将靶向RNA的无切割活性的核酸酶dCas13a和dPspCas13b分别与甲基转移酶结构域和腺嘌呤脱氨酶进行融合,形成的具有甲基转移酶活性的重组核酸酶dCas13a-RsmB与dPspCas13b-RsmB和具有腺嘌呤脱氨酶活性的重组核酸酶dPspCas13b-hADAR。3.一种植物RNA修饰和编辑的方法,其特征在于:应用权利要求1或2所述的植物RNA修饰和编辑系统,将相应功能的酶引导到相应RNA上,实现植物RNA的修饰和编辑。4.如权利要求3所述的一种植物RNA修饰和编辑的方法,其特征在于:利用所述重组核酸酶在靶位点处进行胞嘧啶碱基的甲基化和腺嘌呤碱基的脱氨,最终实现植物RNA的m5C甲基化修饰和A转换为I。5.如权利要求4所述的一种植物RNA修饰和编辑的方法,其特征在于:所述植物RNA的修饰方法包括建立RNAm5C甲基化修饰的体外表达系统;所述体...

【专利技术属性】
技术研发人员:王东刘志红张月婷贺热情
申请(专利权)人:南昌大学
类型:发明
国别省市:江西,36

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