本发明专利技术提供一种亮氨酸脱氢酶突变体的构建及其应用，属于基因工程领域。本发明专利技术提供了SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6及SEQ ID NO.8三个亮氨酸脱氢酶突变体，以及上述突变体或产生突变体的基因工程菌在氨化还原α‑酮酸制备光学纯手性L‑α‑氨基酸中的应用。本发明专利技术在于：所述亮氨酸脱氢酶突变体或含有突变体基因工程菌氨化还原制备L‑α‑氨基酸具有高催化活性及稳定性，能够合成高光学纯度L‑α‑氨基酸(ee>99％)，如突变体酶催化L‑苯甘氨酸的转化速率提高了2.62倍，为其工业化生产提供了一种实际有效策略。
Construction and application of a leucine dehydrogenase mutant
The invention provides a construction and application of a leucine dehydrogenase mutant, belonging to the field of genetic engineering. The present invention provides three leucine dehydrogenase mutants SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.6 and SEQ ID NO.8, as well as the application of the mutant or mutant-producing genetic engineering bacteria in the preparation of optically pure chiral L_a_amino acids by ammoniating and reducing alpha_ketoacid. The invention is that the leucine dehydrogenase mutant or the genetically engineered bacteria containing the mutant have high catalytic activity and stability for ammoniation reduction to prepare L_alpha_amino acid, and can synthesize high optical purity L_alpha_amino acid (ee > 99%). For example, the mutant enzymes catalyze the conversion rate of L_phenylglycine by 2.62 times, which is industrial. Chemical production provides a practical and effective strategy.
【技术实现步骤摘要】
一种亮氨酸脱氢酶突变体的构建及其应用
本专利技术涉及一种亮氨酸脱氢酶突变体的构建及其应用，属于基因工程领域。
技术介绍
光学纯L-α-氨基酸是重要的化工及医药原料，具有广阔的应用市场，如L-α-氨基丁酸可作为抗结核药物盐酸乙胺丁醇和抗癫痫药物左乙拉西坦的合成，L-叔亮氨酸是瑞士罗氏公司研发的酪氨酸激酶JAK3抑制剂药物结构中的中心氨基酸等。亮氨酸脱氢酶(LeuDH，EC1.4.1.9)已被广泛用于L-α-氨基酸的制备(Krix,G.,Bommarius,A.S.,Drauz,K.,Kottenhahn,M.,Schwarm,M.,Kula,M.R..JournalofBiotechnology,1997,53,29-39.)。并且已有部分研究对亮氨酸脱氢酶进行了定点突变改造其性质，但他们都集中改造位于底物催化区域附近、酶表面或特定的氨基酸残基，如徐建妙等选择了41为甘氨酸、77位亮氨酸、61位丙氨酸、347位蛋氨酸及358位谷氨酰胺进行了突变(中国专利:徐建妙,郑裕国,柳志强,傅芳田,胡海峰.亮氨酸脱氢酶突变体、编码基因、载体、工程菌及其应用.2017,CN106497895A.)。但是没有研究报道对于亮氨酸脱氢酶的底物通道进行改造，而底物通道对于酶的催化效率也有着极其重要的影响。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供催化效率及稳定性提高的亮氨酸脱氢酶突变体及其重组工程菌等，为L-α-氨基酸的高效制备提供具备工业价值的生物催化剂。本专利技术的第一个目的是提供一种催化活性显著提高的亮氨酸脱氢酶的突变体，是基于改善亮氨酸脱氢酶底物通道疏水性的基础设计的，主要增加底物通道内β5折叠的刚性。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是在SEQIDNO.2的基础上，将第45位苏氨酸替换为甲硫氨酸，或/和将第116位谷氨酸突变为缬氨酸。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体T45M由SEQIDNO.3所示的基因编码。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体E116V由SEQIDNO.5所示的基因编码。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体将第45位苏氨酸替换为甲硫氨酸，并将116位谷氨酸突变成缬氨酸，得到突变体Thr45Met/Glu116Val，即T45M/E116V。本专利技术的第二个目的是提供编码所述突变体的DNA。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体将第45位苏氨酸替换为甲硫氨酸，得到突变体Thr45Met，即T45M，含有SEQIDNO.4所示的氨基酸序列。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体将116位谷氨酸突变成缬氨酸，得到突变体Glu116Val，即E116V。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体T45M/E116V由SEQIDNO.7所示的基因编码。本专利技术的第三个目的是提供携带所述DNA的载体，包括但不限于质粒、噬菌体或病毒载体等。在本专利技术的一种实施方式中，所述载体为pET系列载体，例如pET-28a。本专利技术的第四个目的是提供表达所述突变体的细胞系。本专利技术的第五个目的是提供一种提高亮氨酸脱氢酶催化活性的方法，是在SEQIDNO.2的基础上，将第45位苏氨酸替换为甲硫氨酸，或/和将第116位谷氨酸突变为缬氨酸。本专利技术的第六个目的是提供一种表达所述亮氨酸脱氢酶突变体的基因工程菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以细菌或真菌细胞为宿主，其满足重组表达载体稳定自我复制的条件，且能够使所述亮氨酸脱氢酶突变体基因有效表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌包括但不限于大肠杆菌E.coliBL21、E.coliBL21(DE3)、E.coliJM109、E.coliDH5α或E.coliTOP10。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)为宿主。本专利技术的第七个目的是提供一种生产所述亮氨酸脱氢酶突变体蛋白的方法，是培养所述重组表达转化体，诱导获得重组亮氨酸脱氢酶突变体蛋白。在本专利技术的一种实施方式中，所述培养是在LB培养基中进行。在本专利技术的一种实施方式中，所述LB培养基含有蛋白脉10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，pH7.2。在本专利技术的一种实施方式中，所述培养是控制培养液在28℃温度下培养至OD600达到0.6-0.9，加入终浓度为0.1-1.0mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导，于28℃诱导培养12-16h。本专利技术的第七个目的是提供所述亮氨酸脱氢酶突变体或其基因工程菌在偶联提供NADH循环的酶的条件下催化制备L-α-氨基酸中的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用是以α-酮酸为底物，所述的亮氨酸脱氢酶突变体或其重组细胞，以NADH为辅酶，并且偶联提供NADH循环的酶，在20-50℃下，于pH6.0-10.0的缓冲液或水构成的转化反应体系中反应1-4h。在本专利技术的一种实施方式中，α-酮酸包括但不限于2-酮丁酸、2-酮戊酸、三甲基丙酮酸、苯甲酰甲酸、4-甲基-2-氧戊酸或3-甲基-2-氧丁酸。在本专利技术的一种实施方式中，提供NADH循环的酶包括但不限于甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、乙醇脱氢酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述转化体系中底物初始浓度为5-1000mmol/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述转化体系中重组亮氨酸脱氢酶突变体纯酶在反应液中较佳的浓度为0.1-2.0mg蛋白/mL反应液。所述转化体系中菌体的质量用量以菌体湿重计为1-400g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述反应体系中添加的提供NADH循环的酶在反应液中较佳的浓度为0.1-2.0mg蛋白/mL反应液；同时，反应体系中还添加了1-15％甲酸、糖或醇为辅底物，所述的辅底物包括但不限于：甲酸、葡萄糖、异丙醇。在本专利技术的一种实施方式中，反应结束后还进行分离纯化；反应结束后，所述分离纯化包括通过加热去除沉淀蛋白或菌体，将反应液离心，取上清液通过活性炭吸附去除色素，经过减压蒸馏，利用饱和析晶或乙醇沉淀结晶法得到粗品。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法还对粗品进行提纯；粗品提纯的方法为本领域公知技术，包括但不限于色谱分离和/或吸附分离。本专利技术还要求保护所述突变体在制备含氨基酸的产品方面的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术首次对亮氨酸脱氢酶的底物通道内氨基酸残基进行定点突变，增加了底物通道的疏水性并增加了底物通道的刚性，获得了更加稳定并能更高效制备L-α-氨基酸的亮氨酸脱氢酶。本专利技术提供的催化效率及稳定性提高的亮氨酸脱氢酶突变体及其重组工程菌，其中复合突变体T45M/E116V对于几类α-酮酸的催化效率提高了1.30-9.85倍，在60℃的半衰期从原始酶的3.4h提高到29.2h。利用亮氨酸突变体可以实现高效制备L-α-氨基酸，如对于L-苯甘氨酸的转化速率提高了2.62倍，摩尔转化率>99％，具有重要的工业应用价值。具体实施方式实施例1：亮氨酸脱氢酶突变体的构建以含有来源于蜡样芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶基因的pET-28a重组质粒作为模板。以含有突变点的寡核苷酸片段为上游引物，pET-28a质粒上2254附近的寡核苷酸片段为下游引物，具体引物如下(加粗及下划线为突变位点)：PF-T45M：5’-CCGGCTCTTGGTGGAATGAGAATGTGGACATAT-3’PF-E11本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，含有SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，含有SEQIDNO.4、SEQIDNO.6或SEQIDNO.8所示的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体的DNA。3.携带权利要求2所述DNA的载体，其特征在于，所述载体包括质粒、噬菌体或病毒载体。4.表达权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体的细胞。5.一种提高亮氨酸脱氢酶催化活性的方法，其特征在于，在SEQIDNO.2的基础上，将第45位苏氨酸替换为甲硫氨酸，或/和将第116位谷氨酸突变为缬氨酸。6.一种基因工程菌，其特征在于，以细菌或真菌细胞为宿主，表达权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体。7.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，周俊平，王雅玲，陈佳杰，杨套伟，徐美娟，张显，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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