一种促进水稻多细胞融合的方法技术

本申请公开了一种促进水稻多细胞融合的方法，利用不同品种水稻种子的成熟胚，诱导出愈伤组织；酶解获得原生质体，将原生质体混合，利用高分子PEG结合高pH‑高Ca2+洗脱法，诱导细胞融合；最后利用AFLP技术筛选杂合体组成，从而得到多细胞融合杂种。包括以下步骤：A.愈伤诱导；B.酶解；C.收集细胞；D.细胞融合；E.原生质体植板培养；F.杂合体分子鉴定。本发明专利技术利用原生质体融合技术，使多个水稻品种的原生质体彼此融合，形成多细胞杂种并诱导培养出多倍体的方法。

A method of promoting rice multicellular fusion

The present application discloses a method for promoting multicellular fusion of rice by inducing callus from mature embryos of different varieties of rice seeds, obtaining protoplasts by enzymatic hydrolysis, mixing protoplasts, inducing cell fusion by combining high molecular PEG with high pH_high Ca2+ elution method, and finally screening heterozygote composition by AFLP technique. Thus, the multicellular fusion hybrids were obtained. It includes the following steps: A. callus induction; B. enzymatic hydrolysis; C. cell collection; D. cell fusion; E. protoplast Plantlet culture; F. heterozygote molecular identification. The invention utilizes the protoplast fusion technology to fuse the protoplasts of multiple rice varieties with each other to form multicellular hybrid and induce the culture of polyploidy.

【技术实现步骤摘要】
一种促进水稻多细胞融合的方法
本专利技术涉及植物细胞培养生物
，特别涉及一种利用原生质体融合技术促进水稻多细胞融合的方法。
技术介绍
体细胞杂交技术是自19世纪40年代发展起来的一种技术，最初应用于将不同来源的细胞融合为一个细胞，而随着发展衍生出了许多相关技术，如植物原生质体融合、胞质体-细胞融合、细胞核-原生质体融合等。体细胞杂交能够克服有性生殖障碍，在远缘物种中有效转移核基因与胞质基因等，促使优良性状在种内、种间、属间得到交流，从而丰富种质资源库，增加遗传多样性，甚至得到有性杂交无法得到的优良种质资源。植物原生质体培养是将除去细胞壁的裸露的原生质体在无菌条件下，以一种合适的培养基及外加激素成分，使之重新分化并形成完整植株的技术。原生质体融合作为体细胞杂交技术的一种，通过整合两个细胞内的遗传物质，可以打破物种间的生殖隔离，快速改良或创造新的种质材料或品种。此外，由于去除了细胞壁，原生质体更容易用于基因工程操作，现已广泛应用于遗传转化研究，细胞周期，基因表达与信号转导，细胞代谢与调控机制等方面研究。但现有的细胞融合技术基本集中于两个细胞之间的有效融合，而且不论是电融合或化学融合，其细胞融合率均较低。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种促进水稻多细胞融合的方法，利用原生质体融合技术，使多个水稻品种的原生质体彼此融合，形成多细胞杂种并诱导培养出多倍体的方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种促进水稻多细胞融合的方法，利用不同品种水稻种子的成熟胚，诱导出愈伤组织；酶解获得原生质体，将原生质体混合，利用高分子PEG结合高pH-高Ca2+洗脱法，诱导细胞融合；最后利用AFLP技术筛选杂合体组成，从而得到多细胞融合杂种。包括以下步骤：A.愈伤诱导；B.酶解；C.收集细胞；D.细胞融合；E.原生质体植板培养；F.杂合体分子鉴定。所述步骤A.愈伤诱导，进一步包括：挑选饱满、大小一致的水稻种子，以酒精5min和次氯酸钠30min消毒后，接种至愈伤组织诱导培养基，并继代1-2次扩大培养，选择色泽淡黄，长势旺盛，分散性好的愈伤组织快转入液体培养基继续培养，摇床转速30-50rpm，5-10d更换一次培养液。所述步骤A.愈伤诱导，进一步包括：酶解前，将愈伤组织置于黑暗处培养24h。所述步骤A.愈伤诱导使用的愈伤诱导培养基包括：MS+2，4-D2.5mg/L+KT0.5mg/L+水解酪蛋白0.3g/L+脯氨酸1.0g/L+谷氨酰胺0.5g/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+植物凝胶3g/L；调节pH＝5.8。所述步骤A.愈伤诱导使用的愈伤诱导培养基为，液体培养基，其成分包括：MS+2，4-D2.5mg/L+KT0.5mg/L+水解酪蛋白0.3g/L+脯氨酸1.0g/L+谷氨酰胺0.5g/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L；调节pH＝5.8。所述步骤B.酶解，进一步包括：将液体培养的愈伤收集，轻轻弹开愈伤，使组织块尽量分散，用培养液清洗1次，在用CPW盐溶液清洗2-3次，置于CPW盐溶液中预处理5-10min，最后吸掉CPW盐溶液，加入酶解液，27℃黑暗下摇床酶解2-3h，转速30-50rpm。所述CPW盐溶液包括：KH2PO427.2mg/L，KNO3101mg/L，CaCl2·2H2O1480mg/L，MgSO4·7H2O246mg/L，KI0.16mg/L，CuSO4·5H2O0.025mg/L。所述酶解液包括：1.0-2.0％纤维素酶，0.1-0.5％果胶酶，0.1-0.6％离析酶，由CPW盐溶液配制而成。所述CPW盐溶液包括：KH2PO427.2mg/L，KNO3101mg/L，CaCl2·2H2O1480mg/L，MgSO4·7H2O246mg/L，KI0.16mg/L，CuSO4·5H2O0.025mg/L，0.5-0.7M甘露醇；调pH＝5.6-5.7。本专利技术有益效果包括：本专利技术通过将多细胞混合后，施加离析酶再一次处理，使细胞团更加分散，促进异种细胞之间更加充分的接触，从而提高了异源融合率，提高了多细胞融合的效率。多细胞的融合则可以在短时间内聚合大量优良性状，用于快速开发新的种质资源。具体实施方式下面结合实施例详述本专利技术。为使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下举实施例对本专利技术进一步详细说明，但本专利技术并不局限于这些实施例。实现本专利技术的具体技术方案如下：一种促进水稻多细胞融合的新方法，其步骤包括：利用不同品种水稻种子的成熟胚，诱导出愈伤组织，酶解获得原生质体，将原生质体按合适的密度混合，利用高分子PEG结合高pH-高Ca2+洗脱法，诱导细胞融合，最后利用AFLP技术筛选杂合体组成，从而得到多细胞融合杂种。具体的为：1愈伤诱导：挑选饱满、大小一致的水稻种子，以酒精5min和次氯酸钠30min消毒后，接种至愈伤组织诱导培养基，并继代1-2次扩大培养，选择色泽淡黄，长势旺盛，分散性好的愈伤组织快转入液体培养基继续培养，摇床转速30-50rpm，约5-10d更换一次培养液。酶解前，将愈伤置于黑暗处培养24h。其中，愈伤诱导培养基为MS+2，4-D2.5mg/L+KT0.5mg/L+水解酪蛋白0.3g/L+脯氨酸1.0g/L+谷氨酰胺0.5g/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+植物凝胶3g/L；调节pH＝5.8；液体培养基不加植物凝胶。2酶解：将液体培养的愈伤收集，轻轻弹开愈伤，使组织块尽量分散，用培养液清洗1次，在用CPW盐溶液清洗2-3次，置于CPW盐溶液中预处理5-10min，最后吸掉CPW盐溶液，加入酶解液，27℃黑暗下摇床酶解2-3h，转速30-50rpm。其中CPW盐溶液组成为：KH2PO427.2mg/L，KNO3101mg/L，CaCl2·2H2O1480mg/L，MgSO4·7H2O246mg/L，KI0.16mg/L，CuSO4·5H2O0.025mg/L；其中酶解液组成为：1.0-2.0％纤维素酶(OnozukaRS、)，0.1-0.5％果胶酶(OnozukaY-23)，0.1-0.6％离析酶(OnozukaR-10)，由CPW液配制而成；上述CPW盐溶液和酶解液均添加0.5-0.7M的甘露醇，并调pH＝5.6-5.7；3收集细胞：将酶解后的细胞用50um(300目)滤网无菌过滤，用CPW盐溶液清洗1次，600rpm离心8min，加CPW盐溶液调整密度至2-5×105个/ml。4细胞融合：将原生质体按1∶1混合，加入0.5％离析酶处理0-30min，处理后的原生质体用CPW洗2次，原生质体密度调整至1.0-2.0×106个/ml左右，每10-20ml细胞加入2mlPEG诱导融合液(PEG-600030-40g/L，CaCl2·2H2O1.5g/L，KH2PO40.1g/L)。于25℃，30rpm水平恒温摇床中垂直放置12min后加入2m1高Ca2+、高pH洗涤液(Gly7.5g/L，Ca(NO3)247.2g/L，甘露醇30g/L，pH＝10.5)，10min后再加入2ml高Ca2+、高pH洗涤液，10min后于500rpm离心5min。诱导融合后的原生质体经CPW溶液洗涤2次，KPR培养基洗涤1次，调整密度至1×105-2×105个/ml左右，使用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种促进水稻多细胞融合的方法，其特征在于，利用不同品种水稻种子的成熟胚，诱导出愈伤组织；酶解获得原生质体，将原生质体混合，利用高分子PEG结合高pH‑高Ca2+洗脱法，诱导细胞融合；最后利用AFLP技术筛选杂合体组成，从而得到多细胞融合杂种。

【技术特征摘要】
1.一种促进水稻多细胞融合的方法，其特征在于，利用不同品种水稻种子的成熟胚，诱导出愈伤组织；酶解获得原生质体，将原生质体混合，利用高分子PEG结合高pH-高Ca2+洗脱法，诱导细胞融合；最后利用AFLP技术筛选杂合体组成，从而得到多细胞融合杂种。2.根据权利要求1所述促进水稻多细胞融合的方法，其特征在于，包括以下步骤：A.愈伤诱导；B.酶解；C.收集细胞；D.细胞融合；E.原生质体植板培养；F.杂合体分子鉴定。3.根据权利要求1所述促进水稻多细胞融合的方法，其特征在于，所述步骤A.愈伤诱导，进一步包括：挑选饱满、大小一致的水稻种子，以酒精5min和次氯酸钠30min消毒后，接种至愈伤组织诱导培养基，并继代1-2次扩大培养，选择色泽淡黄，长势旺盛，分散性好的愈伤组织快转入液体培养基继续培养，摇床转速30-50rpm，5-10d更换一次培养液。4.根据权利要求1所述促进水稻多细胞融合的方法，其特征在于，所述步骤A.愈伤诱导，进一步包括：酶解前，将愈伤组织置于黑暗处培养24h。5.根据权利要求1所述促进水稻多细胞融合的方法，其特征在于，所述步骤A.愈伤诱导使用的愈伤诱导培养基包括：MS+2，4-D2.5mg/L+KT0.5mg/L+水解酪蛋白0.3g/L+脯氨酸1.0g/L+谷氨酰胺0.5g/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+植物凝胶3g/L；调节pH＝5.8。6.根据权利要求1所述促进水稻多细胞融合的方法，其特征在于，所述步骤A.愈伤诱导使用的愈伤诱导培养基为...

【专利技术属性】
技术研发人员：张国栋，刘佳音，刘鹏飞，徐春莹，葛旭娟，米铁柱，
申请(专利权)人：青岛袁策生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37