基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-luciferase细胞系的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR/Cas9靶向基因组定点修饰技术建立KI‑T2A‑luciferase细胞系的方法，采用CRISPR/Cas9技术在基因组上mmp12基因的3’端原位整合入T2A‑luciferase报告基因，建立了MMP12‑T2A‑luciferase的knock‑in细胞系，并验证了此细胞系中外源基因在基因组上的定点整合。同时利用已报道的对mmp12有激活作用的转录因子STAT3对MMP12‑T2A‑luciferase细胞系进行转录激活，结果表明MMP12‑T2A‑luciferase细胞系内的luciferase表达水平可以准确灵敏地反映细胞系内MMP12蛋白表达水平。该细胞系的建立将有助于mmp12基因功能研究及筛选影响mmp12表达的小分子化学药物，为癌细胞的迁移及其相关研究提供一种新的实验思路及解决方案。

Establishment of KI-T2A-luciferase cell line based on CRISPR/Cas9 targeting genome modification technology

The present invention discloses a method for establishing KI_T2A_luciferase cell line based on CRISPR/Cas9 targeted genomic site-directed modification technology. The knock in cell line of MMP12_T2A_luciferase was established by in situ integration of the 3'end of mmp12 gene into the T2A_luciferase reporter gene on the genome using CRISPR/Cas9 technology, and verified. The site specific integration of foreign genes in the cell line. At the same time, the transcription activation of MMP12 T2A luciferase cell line was performed by using the reported transcription factor STAT3, which could activate mmp12. The results showed that the expression level of luciferase in MMP12 T2A luciferase cell line could accurately and sensitively reflect the expression level of MMP12 protein in the cell line. The establishment of this cell line will be helpful for the functional study of mmp12 gene and screening of small molecule chemicals affecting the expression of mmp12, and provide a new experimental idea and solution for the migration of cancer cells and related research.

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-luciferase细胞系的方法
本专利技术属于分子生物学领域，涉及利用CRISPR/Cas9介导的靶向基因组插入技术建立细胞系，特别涉及一种基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立HEK293-MMP12-KI-T2A-luciferase细胞系的新方法，用于监测内源性mmp12表达活性，可以用于对mmp12有作用的药物筛选。
技术介绍
CRISPR/Cas9技术由细菌和古细菌中存在的II型CRISPR/Cas9获得性免疫系统经人工改造而成，可在真核细胞中实现高度灵活且特异的基因组编辑。该系统是利用CRISPR-derivedRNA(crRNA)通过碱基配对与trans-activatingRNA结合形成复合物，Cas9内切酶在此复合物引导下对与crRNA配对的序列进行定点切割。所以，通过人工设计具有引导作用的与目标DNA片段匹配的sgRNA(singleguideRNA)，可以引导Cas9蛋白对宿主细胞基因组进行识别并发生定点切割，然后通过非同源末端连接(non-homologousendjoining，NHEJ)或同源重组(homologousrecombination，HR)两种修复途径的机制进行修复，实现基因靶向编辑。传统报告基因系统一般通过体外克隆目标基因的启动子来驱动报告基因的表达，检测基因的表达调控主要是通过RT-PCR、WesternBlot和将目标基因启动子克隆到携带报告基因的表达检测载体中等手段来实现。RT-PCR过程繁琐且不稳定，WesternBlot抗体标记费时昂贵，这些都不利于高通量筛选；由于基因组本身存在表观遗传学修饰，将启动子克隆到携带报告基因的表达检测载体中的方法无法模拟基因组的真实状态，因此难以准确反映基因组上基因表达情况。而利用CRISPR/Cas9技术，将报告基因靶向性插入到目标基因下游，使报告基因的表达直接受内源靶基因启动子调控，能够真实反映细胞内真实的转录水平。与锌指核酸内切酶(Zincfingerendonuclease，ZFN)以及类转录激活因子效应物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALEN)相比，CRISPR/Cas9技术具有构建方法简单快捷、突变效率高、成本低廉、安全直观、适用范围广的优点，不仅普遍应用于探索构建分子通路的分子生物学实验，而且越来越广泛用于筛选药物所构建的细胞系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，利用CRISPR/Cas9技术，提供一种基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-luciferase细胞系的新方法。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案：一种基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-luciferase细胞系的方法，其特征在于，按下列步骤实施：1)筛选靶向mmp12基因3′非编码区的sgRNA：在NCBI查找mmp12基因组序列，在目的基因mmp12的终止密码子下游设计并合成相应的sgRNA引物，室温退火后连入pU6-sgRNA1.0，筛选后获得sgRNA表达组件，转染HEK293细胞72小时后提取基因组DNA，对打靶区域进行PCR扩增，将PCR产物变性退火后，利用T7E1酶检测其打靶效率，确定具有最高切割活性的sgRNA；2)构建携带Cas9、sgRNA表达元件的真核表达载体：将打靶效率高的sgRNA3表达组件与Cas9基因克隆至一个表达载体，获得pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNA3-SV40pA；3)构建靶向mmp12基因的打靶载体pUC19/MMP12-donor：所构建的靶向mmp12基因的打靶载体pUC19/MMP12-donor的结构为两部分，其中：第一部分是与断裂位点上下游分别具有相同序列的上下游同源臂；第二部分是位于上下游同源臂之间的待重组入基因组靶位点的T2A-luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pADNA片段；4)KEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系的建立：将1×106HEK293细胞铺到60mm培养皿，24小时后，将4μg的pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNA3-SV40pA与8μg的打靶载体pUC19/MMP12-donor共转HEK293细胞系，待细胞系稳定后，加1.0mg/mL的G418筛选10天，待细胞系稳定后，再加10μg/mL的GCV筛选3周，待细胞系稳定过后，对细胞经有限稀释法进行克隆化，挑选10-50个克隆，进行luciferase活性检测；选择luciferase活性高的克隆化细胞进行PCR鉴定并测序，证实携带荧光素酶报告基因的打靶载体在目标位点处的正确重组，最终获得单一稳定的HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系；5)克隆并构建mmp12基因的转录激活因子STAT3表达载体pUC19/CMV-STAT3，该表达载体pUC19/CMV-STAT3被用于mmp12基因的转录激活实验研究；6)验证HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系中luciferase表达变化是否能够真实反映内源性mmp12基因的相对表达量及表达变化；使用所构建的mmp12基因的转录激活因子STAT3表达载体pUC19/CMV-STAT3分别转染HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系和野生型HEK293细胞系，并对HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系中的luciferase活性及HEK293细胞系中mmp12分子的mRNA表达水平分别进行检测；通过对knock-in细胞系中luciferase表达活性与HEK293细胞中mmp12的mRNA表达水平及变化的比较，进一步验证HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系中的luciferase活性是否能够准确反映MMP12分子的相对表达变化。根据本专利技术，步骤1)中所述的合成相应的sgRNA引物为针对mmp12的终止密码子下游设计的sgRNA，其中：MMP12-sgRNA1序列为：CTCTAAGTAGTGGTACACTG；MMP12-sgRNA2序列为：GGTAACACCACTTGTGTCCT；MMP12-sgRNA3序列为：CTAGGCTACACACAACCCCA；MMP12-sgRNA4序列为：GCATGGTAAGCACATCATTC。进一步地，步骤4)中所述的HEK293细胞系为人胚肾细胞系HEK293。本专利技术的基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-luciferase细胞系的新方法，具有如下优点：采用CRISPR/Cas9技术在基因组上mmp12基因的3’端原位整合入T2A-luciferase报告基因，建立了MMP12-T2A-luciferase的knock-in细胞系，并验证了此细胞系中外源基因在基因组上的定点整合。同时利用已报道的对mmp12有激活作用的转录因子STAT3对MMP12-T2A-luciferase细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI‑T2A‑luciferase细胞系的方法，其特征在于，按下列步骤实施：1)筛选靶向mmp12基因3′非编码区的sgRNA：在NCBI查找mmp12基因组序列，在目的基因mmp12的终止密码子下游设计并合成相应的sgRNA引物，室温退火后连入pU6‑sgRNA1.0，筛选后获得sgRNA表达组件，转染HEK293细胞72小时后提取基因组DNA，对打靶区域进行PCR扩增，将PCR产物变性退火后，利用T7E1酶检测其打靶效率，确定具有最高切割活性的sgRNA；2)构建携带Cas9、sgRNA表达组件的真核表达载体：将打靶效率高的sgRNA3表达组件与Cas9基因克隆至一个表达载体，获得pCMV‑Cas9‑SV40pA‑U6‑sgRNA3‑SV40pA；3)构建靶向mmp12基因的打靶载体pUC19/MMP12‑donor：所构建的靶向mmp12基因的打靶载体pUC19/MMP12‑donor的结构为两部分，其中：第一部分是与断裂位点上下游分别具有相同序列的上下游同源臂；第二部分是位于上下游同源臂之间的待重组入基因组靶位点的T2A‑luciferase‑CMV‑eGFP‑T2A‑Neomycin‑SV40pA DNA片段；4)HEK293‑MMP12‑T2A‑luciferase‑KI细胞系的建立：将1×106HEK293细胞铺到60mm培养皿，24小时后，将4μg的pCMV‑Cas9‑SV40pA‑U6‑sgRNA3‑SV40pA与8μg的打靶载体pUC19/MMP12‑donor共转HEK293细胞系，待细胞系稳定后，加1.0mg/mL的G418筛选10天，待细胞系稳定后，再加10μg/mL的GCV筛选3周，待细胞系稳定过后，对细胞经有限稀释法进行克隆化，挑选10‑50个克隆，进行luciferase活性检测；选择luciferase活性高的克隆化细胞进行PCR鉴定并测序，证实携带荧光素酶报告基因的打靶载体在目标位点处的正确重组，最终获得单一稳定的HEK293‑MMP12‑T2A‑luciferase‑KI细胞系；5)克隆并构建mmp12基因的转录激活因子STAT3表达载体pUC19/CMV‑STAT3，该表达载体pUC19/CMV‑STAT3被用于mmp12基因的转录激活实验研究；6)验证HEK293‑MMP12‑T2A‑luciferase‑KI细胞系中luciferase表达变化是否能够真实反映内源性mmp12基因的相对表达量及表达变化；使用所构建的mmp12基因的转录激活因子STAT3表达载体pUC19/CMV‑STAT3分别转染HEK293‑MMP12‑T2A‑luciferase‑KI细胞系和野生型HEK293细胞系，并对HEK293‑MMP12‑T2A‑luciferase‑KI细胞系中的luciferase活性及HEK293细胞系中mmp12分子的mRNA表达水平分别进行检测；通过对knock‑in细胞系中luciferase表达活性与HEK293细胞中mmp12的mRNA表达水平及变化的比较，进一步验证HEK293‑MMP12‑T2A‑luciferase‑KI细胞系中的luciferase活性是否能够准确反映MMP12分子的相对表达变化。...

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-luciferase细胞系的方法，其特征在于，按下列步骤实施：1)筛选靶向mmp12基因3′非编码区的sgRNA：在NCBI查找mmp12基因组序列，在目的基因mmp12的终止密码子下游设计并合成相应的sgRNA引物，室温退火后连入pU6-sgRNA1.0，筛选后获得sgRNA表达组件，转染HEK293细胞72小时后提取基因组DNA，对打靶区域进行PCR扩增，将PCR产物变性退火后，利用T7E1酶检测其打靶效率，确定具有最高切割活性的sgRNA；2)构建携带Cas9、sgRNA表达组件的真核表达载体：将打靶效率高的sgRNA3表达组件与Cas9基因克隆至一个表达载体，获得pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNA3-SV40pA；3)构建靶向mmp12基因的打靶载体pUC19/MMP12-donor：所构建的靶向mmp12基因的打靶载体pUC19/MMP12-donor的结构为两部分，其中：第一部分是与断裂位点上下游分别具有相同序列的上下游同源臂；第二部分是位于上下游同源臂之间的待重组入基因组靶位点的T2A-luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pADNA片段；4)HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系的建立：将1×106HEK293细胞铺到60mm培养皿，24小时后，将4μg的pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNA3-SV40pA与8μg的打靶载体pUC19/MMP12-donor共转HEK293细胞系，待细胞系稳定后，加1.0mg/mL的G418筛选10天，待细胞系稳定后，再加10μg/mL的GCV筛选3周，待细胞系稳定过后，对细胞经有限稀释法进行克隆化，挑选10-50个克隆，进行luciferase活性检测；选择luciferase活性高的克隆化细胞进行PCR鉴定并测序，证...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏海滨，杜春花，赵俊丽，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61