一种可调控基因表达的人类胚胎干细胞系及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种可调控基因表达的人类胚胎干细胞系及其应用。本发明专利技术可调控基因表达的人类胚胎干细胞系包含可控表达外源性融合蛋白系统和至少一种向导RNA，所述可控表达外源性融合蛋白系统包括四环素诱导表达系统和以Cas9蛋白和具有转录激活活性的p300核心结构域构成的融合蛋白；所述向导RNA为靶向基因启动子区的14bp短序列或针对基因组区域的20bp的长序列。本发明专利技术可实时控制Cas9‑p300在人类胚胎干细胞中表达，实现在人类胚胎干细胞分化的不同阶段特定基因激活和切割双功能，大大的扩展了人类胚胎干细胞在医学和生命科学领域中的应用。

A human embryonic stem cell line capable of regulating gene expression and its application

The invention discloses a human embryonic stem cell line capable of regulating gene expression and its application. A human embryonic stem cell line capable of regulating gene expression comprises a controlled expression system of exogenous fusion proteins and at least one guide RNA. The controlled expression system of exogenous fusion proteins comprises a tetracycline-induced expression system and a fusion protein composed of a Cas9 protein and a P300 core domain with transcriptional activation activity. The guided RNA is either a 14 BP short sequence targeting the promoter region of the gene or a 20 BP long sequence targeting the genome region. The invention can control the expression of Cas9_p300 in human embryonic stem cells in real time, realize the dual functions of specific gene activation and cleavage at different stages of human embryonic stem cell differentiation, and greatly expand the application of human embryonic stem cells in the fields of medicine and life sciences.

【技术实现步骤摘要】
一种可调控基因表达的人类胚胎干细胞系及其应用
本专利技术属于基因工程和生物
，涉及由CRISPR/Cas9介导的可控性激活切割双系统的Cas9-p300人类胚胎干细胞系及其构建方法及其应用。
技术介绍
人类胚胎干细胞是一种多潜能性细胞，来自早期胚胎(4-5d)的内细胞团，具有自我更新和多向分化的潜能。1998年，美国科学家JamesThomson首次体外成功培养人类胚胎干细胞，人类胚胎干细胞的科学研究和临床应用也拉开的帷幕。目前研究中，胚胎干细胞已经成功的分化成滋养层细胞、神经细胞、肝细胞、软骨细胞、造血细胞、心肌细胞等多种细胞，也成功的建立了个体发育模型，同时正在向干细胞的移植来重建机体功能和干细胞基因治疗等临床治疗方向努力发展，虽然胚胎干细胞的研究前景令人很乐观，但是也存在很多困难，如细胞培养技术条件要求高，资金消耗大等问题。CRISPR/Cas(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats/CRISPR-Associatedsystems)，全名是常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统，是细菌及古生菌的一种获得性免疫系统，能够通过单链RNA识别外源双链DNA，并借助Cas9核酸酶切割外源DNA，抵御外源DNA侵袭。2013年，张锋等科学家首次报道了CRISPR-Cas9系统在哺乳动物基因组编辑中的应用，开启了CRISPR-Cas9强大的基因编辑功能成为生命科学领域的新星，获得广泛研究和应用，近些年针对CRISPR-Cas9系统中的成份进行不同的修饰和更改，如突变Cas9中活性区的重要的氨基酸和缩短向导RNA的长度，来控制Cas9核酸酶是切割活性。非同源末端连接(NHEJ)和同源重组修复(HDR)，是机体DNA受到损伤时常见的DNA修复机制，其中，NHEJ为主，HDR为辅，目前，基因敲入方法主要是基于后者HDR机制，此方法具有精确基因编辑的效果，但是存在效率低问题，当在大规模进行基因敲入时，这将给实验带来很大不方便，因此NHEJ是我们实验所关注的重点。定点在AAVS1位点进行外源基因的敲入，在即往的研究中已证明不影响整个细胞的生理过程和机制功能，因此我们利用CRISPR-Cas9核酸酶在AAVS1位点进行切割，利用机体的自身的NHEJ修复机制进行基因敲入，发现效率可观。P300蛋白具有组蛋白乙酰转移酶活性，可使染色质结构重构，暴露基因的启动子和增强子于转录因子，起到调控基因的表达.有报导指出p300蛋白的基因激活作用效果优于VP64等相似功能蛋白，但其在基因修饰领域的应用仍少于VP64等传统作用因子。本专利技术将Cas9-p300基因定点敲入人类胚胎干细胞的AAVS1位点，结合四环素(DOX)诱导控制系统，实现实时控制Cas9-p300在人类胚胎干细胞的特定阶段表达，实现特定基因激活和切割双功能，可在人类胚胎干细胞分化的不同阶段实现单个或多个基因的激活或切割，或者基因激活和切割同时实现，从而扩大了人类胚胎干细胞应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：提供一种可控性表达Cas9-p300融和蛋白的人类胚胎干细胞系及其构建方法及其应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了一种可调控基因表达的人类胚胎干细胞系，其包含可控表达外源性融合蛋白系统和至少一种向导RNA，所述可控表达外源性融合蛋白系统包括四环素诱导表达系统和以Cas9蛋白和具有转录激活活性的p300核心结构域构成的融合蛋白；所述向导RNA为靶向基因启动子区的14bp短序列或针对基因组区域的20bp的长序列，。其中，所述基因启动子区位于MYOD1、IL1RN、HBG1、FOXA2、SOX17、NKX2.1和miR145。所述基因组区域位于CCR5、IL1RN、HBG1和OCT4。本专利技术还提供了一种供体表达载体，用于表达所述可控表达外源性融合蛋白系统，包括以下四个部分：第一部分，控制系统元件，包括CMV启动子，M2rtTA表达序列，SV40polyA；第二部分，融和蛋白表达元件，包括TRE启动子，Cas9-p300表达序列，SV40polyA；第三部分，体内线性化元件，包括位于供体载体两端方向相同的23bp的AAVS1gRNA识别序列；第四部分，抗性筛选元件，包括T2A，puromycin抗性基因表达序列，bGHpolyA。本专利技术还提供了上述可调控基因表达的人类胚胎干细胞系的构建方法，是通过CRISPR-CAS9切割基因组CRISPR-CAS9切割基因组AAVS1位点和供体载体两端AAVS1位点，并利用非同源末端直接连接把线性化的供体表达载体上有目的基因的片段敲入基因组AAVS1位点。本专利技术基于长短向导RNA导致Cas9核酸酶表现不同活性，其中20bp长向导RNA与Cas9形成的复合物具有识别和切割DNA双链的功能，14bp的短向导RNA与Cas9形成的复合物仅有识别功能无切割功能。因此，本专利技术的可调控基因表达的人类胚胎干细胞系可用于DNA靶向激活/切割。具体方法包括如下步骤：(1)将可控表达外源性融合蛋白系统敲入人类胚胎干细胞系；(2)构建表达向导RNA的载体，包括长向导RNA和/或短向导RNA；(3)加入四环素，诱导步骤(1)所得人类胚胎干细胞系中Cas9-p300表达；(4)将步骤(2)所得表达向导RNA的载体通过电转转入步骤(1)所得人类胚胎干细胞系，细胞内表达的融合蛋白与向导RNA结合，将Cas9-p300融合蛋白靶向目标基因区，实现基因的激活和/或切割。相对于现有技术，本专利技术具有如下优点和有益效果：本专利技术实现基因敲入的方法是基于基因修复机制中的NHEJ，相比于传统的基因敲入方法的HDR原理，本专利技术不仅大大的降低了构建质粒的难度，而且实现了高效率基因敲入。本专利技术实现了在人类胚胎干细胞中，基于CRISPR/Cas9系统基因激活的功能，这可以使人类胚胎干细胞在分化的不同阶段实现特定单个或多个基因的激活。本专利技术实现了在人类胚胎干细胞中，一个系统中同时实现了基因的切割和激活功能，这将给人类胚胎干细胞应用拓展更大的空间。附图说明图1是pBLuSKP质粒图谱。图2是pBLuSKP-AAVS1-AAVS1质粒图谱。图3是Puro-Cas9-donor质粒图谱。图4是AAVS1-Neo-M2rtTA质粒图谱。图5是Cas9-M2rtTA-puro质粒图谱。图6是pBLu-AAVS1-Cas9-M2rtTA-AAVS1质粒图谱。图7是pBLu-AAVS1-oligo-M2rtTA-AAVS1质粒图谱。图8是P2U6-pCAG-Cas9-p300baeIMutant-mcherry质粒图谱。图9是pBLu-AAVS1-Cas9-p300baeIMutant-M2rtTA-AAVS1质粒图谱。图10是pU6-sEFgRNA质粒图谱。图11是pU6-sgAAVS1-gEFRNA质粒图谱。图12是本专利技术基因敲入系统的PCR基因型鉴定的引物设计的位置。图13是本专利技术基因敲入系统PCR基因型鉴定结果。图14是本专利技术可控激活和切割双系统正交性鉴定结果，(a)短向导RNA激活基因HBG1、IL1RN和MYOD1的RT-PCR结果图；(b)长的向导RNA和短的向导的RNA切割基因组HBG1、I本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可调控基因表达的人类胚胎干细胞系，其特征在于，包含可控表达外源性融合蛋白系统和至少一种向导RNA，所述可控表达外源性融合蛋白系统包括四环素诱导表达系统和以Cas9蛋白和具有转录激活活性的p300核心结构域构成的融合蛋白；所述向导RNA为靶向基因启动子区的14bp短序列或针对基因组区域的20bp的长序列。

【技术特征摘要】
1.一种可调控基因表达的人类胚胎干细胞系，其特征在于，包含可控表达外源性融合蛋白系统和至少一种向导RNA，所述可控表达外源性融合蛋白系统包括四环素诱导表达系统和以Cas9蛋白和具有转录激活活性的p300核心结构域构成的融合蛋白；所述向导RNA为靶向基因启动子区的14bp短序列或针对基因组区域的20bp的长序列。2.根据权利要求1所述的可调控基因表达的人类胚胎干细胞系，其特征在于，所述基因启动子区位于MYOD1、IL1RN、HBG1、FOXA2、SOX17、NKX2.1和miR145。3.根据权利要求1所述的可调控基因表达的人类胚胎干细胞系，其特征在于，所述基因组区域位于CCR5、IL1RN、HBG1和OCT4。4.一种供体表达载体，其特征在于，该表达载体用于表达权利要求1所述的可控表达外源性融合蛋白系统。5.根据权利要求4所述的供体表达载体，其特征在于，其包括以下四个部分：第一部分，控制系统元件，包括CMV启动子，M2rtTA表达序列，SV40polyA；第二部分，融和蛋白表达元件，包括TRE启动子，Cas9-p300表达序列，SV40polyA；第三部分，体内线性化元件，包括位于供体载体两端方向相同的23bp的AAVS1gRNA识别序列；第四部分，抗性筛选元...

【专利技术属性】
技术研发人员：荣知立，林瑛，马淑凤，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44