利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法技术

本发明专利技术涉及一种利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法，其特征是：包括如下步骤：1)CRISPR/Cas9打靶质粒的构建；2)供体质粒的构建；3)分选原代单核细胞；4)电脉冲穿孔法转染单核细胞；5)敲入效率的鉴定。本发明专利技术方法具有简便易行，无需后期细胞筛选，即可获得较高的基因编辑效率，这大大增加了实验的可行性和应用前景。适用范围广等特点。

Construction of Hutat2:Fc gene knock in mononuclear cells by CRISPR/Cas9 Technology

The invention relates to an experimental method for constructing Hutat 2:Fc gene knock-in monocytes using CRISPR/Cas9 technology, which is characterized by the following steps: 1) construction of CRISPR/Cas9 target plasmid; 2) construction of donor plasmid; 3) sorting of primary monocytes; 4) transfection of monocytes by electroporation; 5) identification of knock-in efficiency. The method has the advantages of simplicity and practicability, high gene editing efficiency can be obtained without late cell screening, which greatly increases the feasibility and application prospect of the experiment. The scope of application is wide.

【技术实现步骤摘要】
利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法
本专利技术涉及一种实验方法，具体是一种利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法。属于医学领域。
技术介绍
近年来，获得性免疫缺陷病毒(HIV)的感染率逐年升高。抗病毒药物的发现和普及，使得HIV感染已经由一种急性致死性疾病逐渐变为一种慢性可控性疾病。随着患者生存时间的延长，HIV感染并发症发病率逐年提高，其中HIV相关神经认知紊乱受到广泛关注。HIV相关神经认知紊乱在HIV感染者中的发病率为40％-60％，大大的影响着患者的生存质量。经研究发现，HIV转录激活因子(HIV-Tat)在HIV相关神经认知紊乱的发生发展中扮演着重要角色：一方面，HIV-Tat本身作为一种神经毒性因子可以直接损伤神经元和胶质细胞，另一方面，HIV-Tat可以激活HIV的转录和复制，促进HIV在神经系统中的扩散。因此，中和HIV-Tat对于HIV相关神经紊乱的治疗中具有重要意义。由于血脑屏障的存在，普通的抗病毒药物无法到达中枢神经系统发挥药物作用，因此找到合适的穿越血脑屏障的方法不仅具有科学研究意义，也具有实际应用价值。常用的穿越血脑屏障的方法有以下几种：受体或载体介导的胞吞机制，电磁场、超声波等瞬时开放侵袭性手段以及细胞介导的跨越血脑屏障机制。其中，胞吞机制的实施对药物要求高，操作难度大，而且药物持续时间短；侵袭性手段的实施局部损伤大，患者耐受性差，这些方法实用价值较低。在中枢神经系统细胞治疗方面单核细胞具有明显的优势。但是单核细胞体外增值和表达能力较差，目前还没有一种行之有效的针对单核细胞的基因编辑技术，从而大大限制了单核细胞在中枢神经系统治疗中的应用。目前传统的基因编辑方法，慢病毒/腺病毒介导的细胞感染技术，脂质体介导的细胞转染技术以及ZFN/TALEN介导的基因定点插入技术。病毒介导的转染技术具有明显的生物安全问题，且其造成的基因随机整合可能影响基因组的稳定性；脂质体介导的细胞转染技术治疗性基因无法长期稳定表达；ZFN/TALEN介导的基因定点插入技术操作难度大，编辑效率低。如何将人源化的抗HIV-Tat抗体-Fc融合蛋白Hutat2:Fc敲入单核细胞，以期达到治疗目的是目前要解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法。本专利技术方法具有简便易行，无需后期细胞筛选，即可获得较高的基因编辑效率，这大大增加了实验的可行性和应用前景。适用范围广等特点。本专利技术的目的是通过以下措施来实现的：利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法，其特征是：包括如下步骤：1)CRISPR/Cas9打靶质粒的构建；2)供体质粒的构建；3)分选原代单核细胞；4)电脉冲穿孔法转染单核细胞；5)敲入效率的鉴定。所述步骤1)CRISPR/Cas9打靶质粒的构建；具体如下：a)筛选得到针对人体基因组AAVS1位点的靶序列为SEQIDNo.1：GGGGCCACTAGGGACAGGATTGG；b)针对上述位点，设计并合成sgRNA序列，具体为F-sgRNA序列为SEQIDNo.2：5’-3’CACCGGGGGCCACTAGGGACAGGATTGG；R-sgRNA序列为SEQIDNo.3：5’-3’AAACCCAATCCTGTCCCTAGTGGCCCCC；F-sgRNA序列和R-sgRNA序列为合成的单链DNA片段；c)将上述合成的单链DNA片段进行退火，形成双链DNA片段；d)选取pX330质粒:pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9，利用限制性内切酶BbsⅠ对pX330质粒进行酶切；酶切体系建立：pX330质粒：1微克，10×缓冲液：2微升，BbsⅠ：1微升，去离子水：将总体系补齐至20微升，37℃孵育30分钟，利用T4连接酶将退火后的双链DNA片段连入pX330质粒；连接体系建立：将上述酶切产物：100纳克，双链DNA片段：200纳克，10×缓冲液：2微升，T4连接酶：0.5微升，去离子水：将总体系补齐至20微升，室温孵育30分钟；将连接产物转化入DH-5α感受态细胞，挑取单克隆后测序验证并提取质粒以备后用。所述退火条件：95℃5分钟；95℃开始，每循环2秒钟，每循环下降0.1℃，共200个循环；到达75℃，每循环1秒钟，每循环下降0.1℃，600个循环；15℃2分钟。所述步骤2)供体质粒的构建:利用T4连接酶于目的序列Hutat2:Fc的两端各连入～1.5kb针对基因组AAVS1位点靶序列上下游的同源臂序列，选取PTA2质粒作为供体质粒载体，利用BamHⅠ和HindⅢ对PTA2质粒进行双酶切，利用T4连接酶将目的片段和同源臂序列连入PTA2载体中，30分钟后将连接产物转化入DH-5α感受态细胞，挑取单克隆后测序验证并提取质粒以备后用。所述步骤3)分选原代单核细胞具体为：从血库取全血10毫升，按照体积比1:20加入单核细胞阴选抗体，室温孵育20分钟后，按照体积比1:1加入PBS缓冲液进行稀释，混匀后，将20毫升稀释血液沿试管壁缓慢的叠加到10毫升淋巴细胞分离液之上，并与分离液面形成明显的界面；梯度离心2000转/分钟离心20分钟，收集离心后的环状乳白色淋巴细胞层；加入40毫升PBS缓冲液，1200转/分钟离心10分钟，重复两次。按照体积比9:1加入NH4Cl溶液于冰上孵育10分钟以裂解红细胞。加入10毫升PBS缓冲液，1200转/分钟离心5分钟，重复两次以备后用。所述步骤4)电脉冲穿孔法转染单核细胞：取5×105个单核细胞重悬于200微升电转缓冲液，并置于电转杯中，加入2微克打靶质粒和8微克供体质粒，操作过程中不能产生气泡，将电转杯置于冰上5-10分钟，于电穿仪上进行电穿，电穿完成后迅速将细胞悬液转移至1640完全培养基中，置于37℃，体积百分数为5％CO2中培养9天以基因编辑。所述步骤4)中的电脉冲穿孔条件：电压为1200V，时间为20ms，脉冲为3pulses。所述步骤5)敲入效率鉴定：通过Sanger测序或PCR检测目的序列的整合。本专利技术的优点：1)该方法简便易行，将CRISPR/Cas9技术与电穿孔的转染方法结合，使其更加适用于原代悬浮细胞的基因编辑，即便是对于单核细胞中这种难转染细胞也可以获得较高的编辑效率；2)该方法无需后期细胞筛选，即可获得较高的基因编辑效率，这大大增加了实验的可行性和应用前景。3)该方法适用范围广，对于10-10000bp长度的基因片段的敲入均适用，可以完全满足一般科研的需要。4)该方法将基因片段敲入安全区AAVS1位点，不会影响原代单核细胞的正常功能，尤其是保护了单核细胞迁徙能力，这大大增加了基因修饰后单核细胞穿过血脑屏障进入中枢神经系统的可能性，为未来运用于中枢神经系统的细胞治疗提供了更为科学有效的实验方法。下面通过具体实施例对本专利技术做进一步详细说明，但不作为对本专利技术的限定。附图说明图1是供体质粒构建示意图；图2是单核细胞Hutat2:Fc敲入效率分析；图3是敲入的单核细胞分泌Hutat2:Fc蛋白情况分析；图4是分泌的Hutat2:Fc蛋白对HIV-Tat引起神经本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法，其特征是：包括如下步骤：1)CRISPR/Cas9打靶质粒的构建；2)供体质粒的构建；3)分选原代单核细胞；4)电脉冲穿孔法转染单核细胞；5)敲入效率的鉴定。

【技术特征摘要】
1.利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法，其特征是：包括如下步骤：1)CRISPR/Cas9打靶质粒的构建；2)供体质粒的构建；3)分选原代单核细胞；4)电脉冲穿孔法转染单核细胞；5)敲入效率的鉴定。2.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法，其特征是：所述步骤1)CRISPR/Cas9打靶质粒的构建；具体如下：a)筛选得到针对人体基因组AAVS1位点的靶序列为SEQIDNo.1：GGGGCCACTAGGGACAGGATTGG；b)针对上述位点，设计并合成sgRNA序列，具体为F-sgRNA序列为SEQIDNo.2：5’-3’CACCGGGGGCCACTAGGGACAGGATTGG；R-sgRNA序列为SEQIDNo.3：5’-3’AAACCCAATCCTGTCCCTAGTGGCCCCC；F-sgRNA序列和R-sgRNA序列为合成的单链DNA片段；c)将上述合成的单链DNA片段进行退火，形成双链DNA片段；d)选取pX330质粒:pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9，利用限制性内切酶BbsⅠ对pX330质粒进行酶切；酶切体系建立：pX330质粒：1微克，10×缓冲液：2微升，BbsⅠ：1微升，去离子水：将总体系补齐至20微升，37℃孵育30分钟，利用T4连接酶将退火后的双链DNA片段连入pX330质粒；连接体系建立：将上述酶切产物：100纳克，双链DNA片段：200纳克，10×缓冲液：2微升，T4连接酶：0.5微升，去离子水：将总体系补齐至20微升，室温孵育30分钟；将连接产物转化入DH-5α感受态细胞，挑取单克隆后测序验证并提取质粒以备后用。3.根据权利要求2所述的利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法，其特征是：所述退火条件：95℃5分钟；95℃开始，每循环2秒钟，每循环下降0.1℃，共200个循环；到达75℃，每循环1秒钟，每循环下降0.1℃，600个循环；15℃2分钟。4.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的...

【专利技术属性】
技术研发人员：康文，王博文，孙永涛，左佳蕙，康文臻，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61