猪白细胞介素4/6与融合猪抗菌肽共表达重组酵母菌制剂的制备及应用制造技术

本发明专利技术公开了猪白细胞介素4/6与融合猪抗菌肽共表达重组酵母菌制剂的制备及应用。本发明专利技术所提供的抗菌肽融合细胞因子FPAPIL46为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，本发明专利技术的FPAPIL46可以促进淋巴细胞、红细胞和白细胞的增殖，抑制致病微生物的生长，促进非特异性抗体(IgG、IgG1、IgG2a)及疾病特异抗体的分泌，提高动物的免疫能力与存活率。

Preparation and application of * * recombinant yeast preparation co expressing porcine interleukin 4/6 and porcine antibacterial peptide

This * * invention discloses the preparation and application of recombinant yeast preparation co expressing pig interleukin 4/6 and porcine antibacterial peptide. The antimicrobial peptide fusion cytokine FPAPIL46 provided in the present invention is A1, A2, or A3: A1) amino acid sequence is a protein of sequence 1 in the sequence table; A2) amino acid sequence shown in sequence 1 is substituted and/or deleted and/or added by one or more amino acid residues and has the same function; A3) The fusion protein was obtained from the N terminal or / C end of A1 or A2. Experiments show that the FPAPIL46 can promote the proliferation of lymphocytes, red blood cells and white blood cells, inhibit the growth of pathogenic microorganisms, promote the secretion of non-specific antibodies (IgG, IgG1, IgG2a) and disease-specific antibodies, and improve the immune ability and survival rate of animals.

【技术实现步骤摘要】
猪白细胞介素4/6与融合猪抗菌肽共表达重组酵母菌制剂的制备及应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种猪白细胞介素4/6与融合猪抗菌肽共表达重组酵母菌制剂的制备及应用。
技术介绍
目前中国畜禽养殖业随着集约化程度提高，畜禽养殖规模和养殖密度日益扩大，迫于控制30多种传染性病原感染传播扩散的压力，尤其是禽流感和呼吸繁殖综合症等烈性病相继循环爆发，动物养殖中耐药菌引起的腹泻，沙门、大肠杆菌、链球菌、蓝耳病(PRRSV)、圆环病毒(PCV2)、猪瘟(CSFV)等各种细菌、病毒性疾病，长期以来是畜牧养殖中瓶颈限制问题，严重阻碍畜牧业的发展；使抗生素等药物添加剂在饲料的滥用情况非常严重，畜禽疾病和抗生素饲料添加剂的公害问题已经成为制约我国畜禽养殖业发展水平和经济效益提高的瓶颈。饲料抗生素添加剂的滥用不仅提高饲养成本，也导致病原微生物的耐药性和致病力明显增强，严重破坏了动物消化道的微生态平衡，长期使用后在动物体内残留、并富集，畜禽机体因药物毒副作用而削弱健康水平，免疫抗病力显著下降。如此恶性循环，畜禽各种烈性传染疾病频繁发生，难于控制和治疗。而另一方面，药物残留及日益严重的畜禽产品食品安全问题，不仅直接威胁着人类自身的健康，也阻碍了养殖业的发展。动物饲料添加抗生素，长期或不适当使用不仅将诱导病菌出现抗药性，而且在动物产品出现药物残留，造成严重的食品安全隐患，损害人类健康以及招致治疗抗生素的药物失效。欧盟、美国等发达地区2006年开始全面限制抗生素作为饲料添加剂。我国也严格限制饲料添加抗生素。现代养殖业急需开发取代传统抗生素的无残留、无抗性诱导、安全无污染的新型生物饲料及其添加剂。IL4作为调节动物体液免疫的细胞因子，可激活静止的B细胞进入增殖阶段，并诱导分化和产生高水平IgG1和IgE；具有很强的巨噬细胞激活活性，增强其MHC—II分子表达、抗原呈递和吞噬能力；能刺激骨髓造血干细胞的增生，增强机体的造血机能；对T细胞也有较广泛的激活效应，能促进CD4和CD3T细胞的生长，促使活化的T细胞继续生长；并刺激胸腺细胞增生成熟。IL6是功能最为广泛的细胞因子之一，由T细胞和巨噬细胞分泌，刺激免疫反应，促进多种细胞的增殖和分化。例如在炎症中，IL-6起着抵抗感染的作用。在局部感染的地方，内皮细胞，成纤维细胞，单核巨噬细胞分泌IL6以抗病毒，促进局部激活的T细胞增殖生长，从而诱导T细胞分化成熟为细胞毒性T细胞；当IL6释放，进入血液循环后，能使激活静止的造血干细胞，促进血细胞的分裂增殖，诱导或促进其他免疫细胞产生细胞因子并发挥作用；诱导体温的升高，唤醒机体对抗感染的一系列防御性生理应答。抗菌肽分子量小，分离纯化和检验存在一定的困难。目前科研中抗菌肽的主要来源是化学合成，但化学合成成本高，量小，不利于大规模应用。所以，利用基因工程手段，重组连接多个抗菌肽基因，获得具有广谱抗多种微生物(G+、G-、病毒、真菌、寄生虫)和免疫调节活性的高效重组抗菌肽分子。目前少见有关猪白细胞介素融合抗菌肽基因重组克隆和共表达的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何提高动物的免疫能力。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种蛋白质，包括猪抗菌肽和白细胞介素4/6。上述蛋白质为如下a)-e)中任一种蛋白质：a)氨基酸序列包括序列表中序列1所示的氨基酸序列的蛋白质；b)氨基酸序列由序列表中序列1所示的氨基酸残基组成；c)将a)或b)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有提高动物免疫能力功能的蛋白质；d)与a)或b)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有提高动物免疫能力功能的蛋白质；e)a)-d)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。编码上述蛋白的核酸分子也是本专利技术保护的范围。上述核酸分子为如下1)-4)中任一种所示的核酸分子：1)其编码序列包括序列表中序列2；2)其编码序列为序列表中序列2；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码上述蛋白的DNA分子；4)与1)或2)限定的DNA分子具有80％以上或90％以上的同源性且编码上述蛋白的DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列2编码序列1所示的FPAPIL46。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的编码FPAPIL46的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术分离得到的FPAPIL46的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码FPAPIL46且具有FPAPIL46功能，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。下述1)-3)中的任一种生物材料也是本专利技术保护的范围：1)含有上述核酸分子的表达盒；2)含有上述核酸分子的重组载体；3)含有上述核酸分子的重组菌或转基因细胞系；4)所述重组菌的发酵产物。上述应用中，B2)所述的含有编码FPAPIL46的核酸分子的表达盒(FPAPIL46基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达FPAPIL46的DNA，该DNA不但可包括启动FPAPIL46基因转录的启动子，还可包括终止FPAPIL46基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用现有的载体构建含有所述FPAPIL46基因表达盒的重组载体。上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pGAPZαA载体。B3)所述重组载体可含有序列2所示的用于编码FPAPIL46的DNA序列。进一步所述重组载体具体可为pG-46P。所述pG-46P为将pGAPZαA载体的EcoRI和XbaI识别序列间的DNA片段替换为序列2所示的FPAPIL46基因，得到的重组载体。上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，酵母可为毕赤酵母SMD1168。上述应用中，所述重组微生物可为将含有编码FPAPIL46的核酸分子的表达盒导入酵母中得到的重组微生物。所述重组微生物具体可为将含有FPAPIL46表达盒的重组载体导入酵母中得到的重组微生物。在将重组载体导入所述酵母中，可直接将重组载体导入所述酵母中，也可现将重组载体线性化后再导入所述酵母中。所述酵母可为毕赤酵母SMD1168。在本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质，包括猪抗菌肽和白细胞介素4/6。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，包括猪抗菌肽和白细胞介素4/6。2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为如下a)-e)中任一种蛋白质：a)氨基酸序列包括序列表中序列1所示的氨基酸序列的蛋白质；b)氨基酸序列由序列表中序列1所示的氨基酸残基组成；c)将a)或b)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有提高动物免疫能力功能的蛋白质；d)与a)或b)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有提高动物免疫能力功能的蛋白质；e)a)-d)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。3.编码权利要求1或2所述蛋白的核酸分子。4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下1)-4)中任一种所示的核酸分子：1)其编码序列包括序列表中序列2；2)其编码序列为序列表中序列2；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；4)与1)或2)限定的DNA分子具有80％以上或90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。5.下述1)-3)中的任一种生物材料：1)含有权利要求3或4所述核酸分子的表达盒；2)含有权利要求3或4所述核酸分子的重组载体；3)含有权利要求3或4所述核酸分子的重组菌或转基因细胞系；4)所述重组菌的发酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：高荣，万小平，魏泓，肖永乐，吴雪颖，胡立博，朱玉华，刘建华，田玉虎，吕学斌，王泽洲，李江淩，
申请(专利权)人：深圳市前海金卓生物技术有限公司，四川大学，
类型：发明
国别省市：广东,44