一种与p16蛋白特异性结合的单克隆抗体及其在试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种与p16蛋白特异性结合的单克隆抗体，以及所述单克隆抗体在制备用于检测p16蛋白的免疫检测工具中的应用，以及含所述单克隆抗体的免疫组化试剂盒。本发明专利技术所述单克隆抗体可与p16蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了p16蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤细胞内p16蛋白表达水平，可用于检测肺癌、肝癌、恶性胶质瘤、黑素瘤、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌等相关肿瘤组织中p16的表达水平。

A monoclonal antibody specifically binding to p16 protein and its application in kits

The invention provides a monoclonal antibody specifically binding to p16 protein, and the application of the monoclonal antibody in the preparation of an immunoassay tool for detecting p16 protein, and an immunohistochemical kit containing the monoclonal antibody. The monoclonal antibody can specifically bind to p16 protein, and has no cross-reaction with other intracellular proteins. The specificity, accuracy and reliability of immunoassay for p16 protein are significantly improved, and the expression level of p16 protein in tumor cells is truly reflected. The monoclonal antibody can be used to detect lung cancer, liver cancer, malignant glioma, melanoma and so on. The expression of p16 in ovarian cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, colon cancer, cervical cancer and other related tumors.

【技术实现步骤摘要】
一种与p16蛋白特异性结合的单克隆抗体及其在试剂盒中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于检测p16蛋白的单克隆抗体及其在试剂盒中的应用。
技术介绍
自从20世纪40年代用于子宫颈癌前病变筛查的巴氏细胞学检验以来，子宫颈癌的发病率和死亡率明显降低了。然而，巴氏细胞学检验的效果受到被检测者之间的个体差异的影响，假阴性和假阳性率分别在20-30％和5-70％之间。近年来，在临床实践中引入了人乳头状瘤病毒(HPV)DNA检验对进一步改善初级筛选、分类和治疗后监测的效果带来了希望，且最近公布的随机临床试验结果已经证明，HPV检验可以有效地整合到子宫颈癌初级筛查中，作为细胞学的主要辅助或唯一的检测。但是，即使实施作为初步筛选试验，HPV检验在子宫颈低级病变的筛查中是不成功的，所以有必要具有更多的特异性标志物来鉴定阴道镜检查。此外，虽然单一HPV的DNA检测可以确认病毒的感染，但是无法区分短暂性和持续性感染，其中这两种类型感染之间的区别是至关重要的，因为易于发展形成子宫颈瘤的是持续性感染，而不是暂时性的。之外，即使是一直被认为是“金标准”的子宫颈组织学活检，也可能受到观察者和被观察者之间变异性的影响。所以应用新的组织标本标记物鉴定筛查子宫颈病变以改善病人样本的不确定性成为了研究者的研究重点。目前，肿瘤抑制蛋白p16INK4a(p16)已被确定为HPV感染后病变进展中的生物标志物。在正常生理状态下，p16蛋白能阻断细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4/6的通路。HPV感染后病变的子宫颈组织中，病毒癌基因E6和E7能干扰细胞的周期调节，其中，病毒癌基因E7与视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)竞争性结合到E2F转录因子，从而促进细胞周期进程，而这一过程通常是由CDK4/6来激活的，受影响的细胞反馈性地强烈表达p16以抵抗不规则的细胞周期调节。然而，由于E2F转录因子不是通过CDK4/6作用释放，而是通过病毒癌基因E7释放的，所以p16表达对细胞周期调节是没有影响。故而，随着时间的推移，p16累积在受影响的细胞的细胞核和细胞质中，可以通过免疫组化染色进行检测。所以通过检测p16蛋白标记物有利于提高诊断HPV感染子宫颈后癌变的准确性。最近的研究表明：转录活性高的HPV可导致非常高水平的p16表达；而低风险HPV病毒编码的E7蛋白在某些生物化学和生物学性质方面均不同于高风险HPV编码的，会直接导致在感染低风险HPV病毒的细胞中未观察到p16蛋白积累表达。鉴于此原因，通过免疫组化检测到的p16蛋白过表达可以作为鉴定肿瘤中高危HPV感染的敏感标记。另外，最新研究还表明p16能够在许多其他癌症中进行表达，例如脂肪肉瘤、胃腺癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺腺癌、神经内分泌癌和非HPV感染机制导致的子宫癌等，其中基因缺失、点突变、功能突变或者Rb通路失调导致pRb的失活是这些非HPV感染肿瘤高表达p16蛋白的主要原因。迄今为止，利用免疫组织化学技术检测p16表达对于诊断以上癌症具有重要的意义。免疫组织化学是利用抗体能特异性结合抗原的特性，再通过抗体上标记物的显色，来检测或者定位组织或细胞中的某种蛋白质物质的技术。但是，常规的免疫组织化学技术耗时长，整个过程至少需要数小时才能完成，以致利用免疫组织化学技术检测p16表达不能及时、快速、有效地得到结果，从而阻碍了其诊断癌症的临床应用。自单克隆抗体问世以来，由于其独有的特征已迅速应用于检验医学诊断试剂。作为检验医学诊断试剂，单克隆抗体因其具有特异性强、纯度高、均一性好等优点而广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术。同时单克隆抗体的应用，很大程度上促进了商品化试剂盒的发展。目前，应用单克隆抗体制作的商品化试剂盒广泛应用于：①病原微生物抗原、抗体的检测；②肿瘤抗原的检测；③免疫细胞及其亚群的的检测；④激素测定；⑤细胞因子的测定。不同商品化试剂盒因使用的单克隆抗体不同，识别抗原的位点不同，导致检测结果有一定差异。而现有技术的单克隆抗体对p16蛋白检测的特异性和灵敏度不高。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种与p16蛋白特异性结合的单克隆抗体，并且本专利技术还提供了所述单克隆抗体在制备用于检测p16蛋白的免疫检测工具中的应用及其在制备用于标记组织脱落细胞的试剂盒中的应用。在本专利技术的第一方面，提供一种与p16蛋白特异性结合的单克隆抗体，所述单克隆抗体蛋白序列为：QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNAEVKDWVRQAPGKGLEWVSTAHIGNGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRAGRTARPHEKLWGQGTLVTVSSAAAEQKLISEEDLNSAAHYTDIEMNRLGKGAA。所述单克隆抗体与p16蛋白表露在表面的氨基酸序列能进行特异性结合，符合细胞免疫化学染色的特性，无需进行过多的抗原修复的处理，可特异性检测细胞的p16蛋白表达。在本专利技术的第二方面，提供一种人p16抗原合成肽，所述人p16抗原合成肽用于制备上述单克隆抗体且所述人p16抗原合成肽的氨基酸序列为：VLALHSGINQEGETEASSVSQNADNFNVAGYICNYIAK。在本专利技术的第三方面，提供上述单克隆抗体的制备方法，其包括如下步骤：S1.利用辅助噬菌体侵染制备出能用于筛选的单域抗体噬菌体文库；S2.利用噬菌体展示技术对人p16抗原合成肽的单域抗体文库进行至少5轮洗脱富集，再筛选出能特异性结合人p16抗原合成肽的单域抗体，测序获得序列；S3.原核可溶性表达纯化与人p16抗原合成肽特异性结合能力高的单域抗体，即得所述单克隆抗体。优选地，所述单克隆抗体的制备方法，其包括如下步骤：S1.利用辅助噬菌体K13侵染细菌制备出能用于筛选的单域抗体噬菌体文库；S2.利用噬菌体展示技术对人p16抗原合成肽的单域抗体文库进行至少5轮洗脱富集，再筛选出能特异性结合人p16抗原合成肽的单域抗体，测序获得序列；S3.原核可溶性表达纯化与人p16抗原合成肽特异性结合能力高的单域抗体，即得所述单克隆抗体。在本专利技术的第四方面，提供上述单克隆抗体的用途，其用途为制备用于检测p16蛋白的免疫检测工具。所述免疫检测工具为试剂、试剂盒、芯片或试纸。在本专利技术的第五方面，提供上述单克隆抗体的另一用途，所述用途为制备用于标记组织脱落细胞的试剂盒。优选地，所述组织脱落细胞为肺癌、肝癌、恶性胶质瘤、黑素瘤、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌或相关肿瘤细胞。在本专利技术的第六方面，还提供了一种用于检测p16蛋白的免疫显色试剂盒，其包括上述单克隆抗体。所述免疫显色试剂盒还包括缓冲液PBS-X和PBS-T，清洗液A、B、C，封闭液，苏木素染色液，底物液。优选地，所述缓冲液PBS-X和PBS-T分别为含有12-17M磷酸二氢钠、2-5M氯化钠的水溶液和含有20-30M磷酸二氢钠、1-3M氯化钠、5-15％Tripton的水溶液。优选地，所述缓冲液PBS-X和PBS-T分别为含有15.5M磷酸二氢钠、3.8M氯化钠的水溶液和含有27.8M磷酸二氢钠、1.9M氯化钠、10％Tripton的水溶液。所述清洗液A、B、C分别是95-100％乙醇、65-75％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与p16蛋白特异性结合的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体蛋白序列为：Q V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F NA E V K D W V R Q A P G K G L E W V S T A H I G N G S T Y Y A D S V K G R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A T Y R A G R T A R P H E K L W G Q G T L V T V S S A A A E Q K L I S E E D L N S A A H Y T D I E M N R L G K G A A。

【技术特征摘要】
1.一种与p16蛋白特异性结合的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体蛋白序列为：QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNAEVKDWVRQAPGKGLEWVSTAHIGNGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRAGRTARPHEKLWGQGTLVTVSSAAAEQKLISEEDLNSAAHYTDIEMNRLGKGAA。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体由一种人p16抗原合成肽制备；所述人p16抗原合成肽的氨基酸序列为：VLALHSGINQEGETEASSVSQNADNFNVAGYICNYIAK。3.如权利要求1所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.利用辅助噬菌体侵染制备出能用于筛选的单域抗体噬菌体文库；S2.利用噬菌体展示技术对人p16抗原合成肽的单域抗体文库进行至少5轮洗脱富集，再筛选出能特异性结合人p16抗原合成肽的单域抗体，测序获得序列；S3.原核可溶性表达纯化与人p16抗原合成肽特...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏仲春，邵美云，骆伟明，
申请(专利权)人：广州江元医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44