一种扁柏双黄酮衍生物的制备方法及抗乳腺癌的应用技术

本发明专利技术属于医药技术领域，一种扁柏双黄酮衍生物WG020的制备方法及在抗乳腺癌中的应用，其中扁柏双黄酮为从卷柏属植物深绿卷柏中提取物，在提取得到扁柏双黄酮的基础上合成扁柏双黄酮衍生物WG020。本发明专利技术将WG020进行了细胞毒性实验(MTT法)，流式分析(FCM)乳腺癌细胞凋亡实验，蛋白免疫印迹(WB)分析凋亡机制实验及肿瘤细胞转移抑制实验，结果表明WG020对乳腺癌细胞活性影响具有时间依赖性和浓度依赖性，可以诱导乳腺癌细胞发生凋亡，对乳腺癌细胞转移有较好的抑制作用。因此，扁柏双黄酮衍生物WG020可作为研制新的抗乳腺癌的先导化合物，本发明专利技术为寻求抗乳腺癌药物提供了一种新的来源。

Preparation method of bis flavonoids and its application in breast cancer prevention

The invention belongs to the field of medical technology, a preparation method of Platycladus orientalis biflavone derivative WG020 and its application in anti-breast cancer, wherein Platycladus orientalis biflavone is extracted from Selaginella diffusa, and a Platycladus orientalis biflavone derivative WG020 is synthesized on the basis of extracting Platycladus orientalis biflavone. WG020 was tested for cytotoxicity (MTT), flow cytometry (FCM) for breast cancer cell apoptosis, protein immunoblotting (WB) for apoptosis mechanism and tumor cell metastasis inhibition. The results showed that WG020 had a time-and concentration-dependent effect on breast cancer cell viability and could induce breast cancer fineness. Cell apoptosis can inhibit the metastasis of breast cancer cells. Therefore, the biflavone derivative WG020 of Platycladus orientalis can be used as a leading compound for developing new anti-breast cancer drugs, and the invention provides a new source for seeking anti-breast cancer drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种扁柏双黄酮衍生物的制备方法及抗乳腺癌的应用
本专利技术属于医药
，具体涉及扁柏双黄酮衍生物WG020的制备以及其在抗乳腺癌药物中的应用。
技术介绍
目前，从天然产物或其衍生物中寻找抗肿瘤药物仍然是人类获得抗肿瘤药物的主要手段。据Demain等报道，在1981～2002年间，74％的抗肿瘤药物来源于天然产物、半合成品或以天然产物为模型的全合成品。紫杉醇、羟基喜树碱、秋水仙碱、奥沙利铂、长春新碱和长春地辛等都是从植物中提取得到的抗癌一线治疗药物。因此，从天然植物中寻找高效、特异性强、无毒或低毒的结构新颖的抗癌化合物，或以其为先导化合物来创制新的抗癌药物具有重要意义。来源于中药深绿卷柏提取的扁柏双黄酮，具有抗肿瘤、抗HIV-1逆转录酶、抗流感病毒唾液酸酶及抗氧化等生物活性等。由于扁柏双黄酮难溶于水、体外活性较低、体内循环时间短、口服剂量高、生物利用度低的缺点限制了它在临床上的应用。因此以扁柏双黄酮为先导化合物，对其结构修饰得到新化合物WG020，并探讨WG020抑制乳腺癌的细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡及抑制迁移和侵袭等分子机制，具有重大意义。
技术实现思路
为克服上述问题，本专利技术的目的在于提供一种扁柏双黄酮衍生物在抗乳腺癌药物中的应用，所得到的扁柏双黄酮衍生物WG020具一定的抗乳腺癌效果。为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：扁柏双黄酮衍生物WG020，结构式为式I：在扁柏双黄酮的基础上与TBDPSCl反应选择性保护酚羟基得叔丁基二苯基扁柏双黄酮，叔丁基二苯基扁柏双黄酮再经醋酐乙酰化得四乙酰叔丁基二苯基扁柏双黄酮，然后脱除硅基保护得四乙酰扁柏双黄酮，四乙酰扁柏双黄酮在吡啶作用下与环丁二酸酐反应得四乙酰扁柏双黄酮氧代丁酸，经EDCl,NHS作用得中间体6，化合物6与氨基糖反应得酰胺7，经甲醇钠作用脱除乙酰基保护得到目标产物WG020，合成路线如下：(1)精密称取扁柏双黄酮，加入乙腈溶解，待完全溶解后加入TBSCl和咪唑，室温反应1h，用饱和氯化铵溶液猝灭反应。用二氯甲烷萃取3次，合并萃取液，用无水硫酸钠干燥，浓缩后经硅胶柱层析(氯仿：丙酮＝10:1)，得黄色固体产物叔丁基二苯基扁柏双黄酮，干燥备用。(2)取步骤(1)中的黄色固体产物，加入乙酸酐和吡啶，加热回流1h，抽滤，得黄色固体产物四乙酰叔丁基二苯基扁柏双黄酮，干燥备用。(3)室温下，取步骤(2)中的黄色固体产物，溶于THF中，再滴加TBAF，反应3h，抽滤，得黄色固体产物四乙酰扁柏双黄酮，干燥备用。(4)将四乙酰扁柏双黄酮溶于有机溶剂中，加入吡啶和环丁二酸酐，加热回流24h，抽滤，得黄色固体产物四乙酰扁柏双黄酮氧代丁酸，干燥备用。(5)将四乙酰扁柏双黄酮氧代丁酸溶于无水四氢呋喃中,搅拌并加入N-羟基琥珀酰亚胺和EDCl,氮气保护下室温反应12h。收集滤液并旋干,二氯甲烷萃取并用饱和食盐水洗涤3次,有机相用无水硫酸镁干燥浓缩得到粗产物,粗产物用硅胶柱层析分离(洗脱剂为氯仿：丙酮＝10:1)。得到黄色固体中间体6，干燥备用。(6)将中间体6溶于DMF，加入2-氨基葡萄糖，室温反应过夜，抽滤，得中间体7，干燥备用。(7)取步骤(6)中的黄色固体产物，溶于甲醇，并加入金属钠，在室温下反应2h，抽滤，得WG020，干燥备用。扁柏双黄酮的制备是通过下列方法制备得到：采用工业化逆流色谱仪(英国DynamicExtract公司)应用于深绿卷柏粗提物分离纯化扁柏双黄酮，溶剂体系由正戊烷-乙酸乙酯-甲醇-水组成的两相体系，以600mL/min的速率注入柱中，最终从深绿卷柏粗提物中获得扁柏双黄酮单体，克服了逆流色谱技术分离时间长、分离效率低的技术难点，实现了逆流色谱快速、大规模制备高经济价值单体化合物的技术。WG020对乳腺癌细胞活性影响具有浓度依赖性和时间依赖性。同时。WG020对正常细胞的毒性明显不如乳腺癌细胞。由于WG020对正常细胞的IC50值大于乳腺癌细胞,说明WG020的毒性具有选择性。WG020对乳腺癌细胞的克隆形成具有良好的抑制作用，并且这种作用具有浓度依赖性。WG020可以诱导乳腺癌细胞发生凋亡，且这种凋亡诱导具有一定的浓度依赖性。这说明WG020对乳腺癌细胞有着强烈的凋亡诱导作用，而且这种作用具有浓度依赖性。WG020可以抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时促进促凋亡蛋白Bax的表达，引发凋亡后又激活pro-caspase3完成凋亡过程。这进一步说明了WG020通过诱导凋亡而抑制乳腺癌细胞。本专利技术提供的扁柏双黄酮衍生物WG020，经活性测试证明其具有一定的抗乳腺癌效果，可作为一种高效低毒的抗乳腺癌药物。本专利技术的合成工艺选择性好，原料易得，成本低廉，合成路线简单，便于操作实施，并且合成所得产物毒性小，得率高，产物纯度高，因而该工艺具有高效、便捷、低成本的特点。附图说明图1为本专利技术扁柏双黄酮衍生物WG020的结构式。图2为本专利技术WG020抑制乳腺癌细胞WTT结果。图3为本专利技术WG020抑制乳腺癌细胞凋亡结果。图4为乳腺癌细胞线粒体膜电位和活性氧检测结果。图5为本专利技术WG020抑制乳腺癌细胞4T1和MDA-MB-231的迁移和侵袭图。具体实施方式实施例1扁柏双黄酮的分离采用工业化逆流色谱仪(英国DynamicExtract公司)应用于深绿卷柏粗提物分离纯化扁柏双黄酮，溶剂体系由8:8:9:7的正戊烷-乙酸乙酯-甲醇-水组成的两相体系，按此比例将两相溶剂体系分别经不同的泵以600mL/min的速率注入柱中，转速为600r/min，每次深绿卷柏粗提物的上样量为80g，最终获得扁柏双黄酮单体10g，整个分离时间仅30min，首次突破了逆流色谱技术分离时间长、分离效率低的技术难点，实现了逆流色谱快速、大规模制备高经济价值单体化合物的技术。扁柏双黄酮，黄色粉末，易溶于DMSO。ESI-MSm/z：537[M+H]-，mp256～258℃，1HNMR(d-DMSO，400MHz)，δ：6.84(IH，s，H-3)，5.95(1H，s，H-6)，6.18(IH，s，H-8)，7.83(1H，dd，J＝8.4Hz，H-2’)，6.93(1H，dd，J＝8.4Hz，H-3’)，6.93(1H，dd，J＝8.4Hz，H-5’)，7.83(1H，dd，J＝8.4Hz，H-6’)，6.84(IH，s，H-3”)，6.28(IH，s，H-8”)，7.70(1H，d，J＝8.4Hz，H-2”’)，6.94(1H，d，J＝8.4Hz，H-3”’)，6.94(1H，d，J＝8.4Hz，H-5”’)，7.70(1H，d，J＝8.4Hz，H-6”’)。13CNMR(d-DMSO，400MHz)，δ：182.2(C-4”)，181.9(C-4)，164.2(C-2”)，163.2(C-2)，164.4(C-7)，153.9(C-7”)，161.5(C-5)，153.2(C-5”)，157.4(C-9)，157.4(C-9”)，124.8(C-6”)，99.7(C-6)，103.9(C-3)，102.6(C-3”)，94.0(C-8)，94.7(C-8”)，104.1(C-10)，104.0(C-10”)，121.2(C-l”’)，124.3(C-l’)，128.7(C-2”’)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种扁柏双黄酮衍生物WG020在抗乳腺癌药物中的应用，所述扁柏双黄酮衍生物WG020的结构式为式I：

【技术特征摘要】
2018.03.09 CN 20181019513601.一种扁柏双黄酮衍生物WG020在抗乳腺癌药物中的应用，所述扁柏双黄酮衍生物WG020的结构式为式I：2.如权利要求1所述的扁柏双黄酮衍生物WG020的制备方法，其特征在于，按照如下合成路线进行：在扁柏双黄酮的基础上与TBDPSCl反应选择性保护酚羟基得叔丁基二苯基扁柏双黄酮，叔丁基二苯基扁柏双黄酮再经醋酐乙酰化得四乙酰叔丁基二苯基扁柏双黄酮，然后脱除硅基保护得四乙酰扁柏双黄酮，四乙酰扁柏双黄酮在吡啶作用下与环丁二酸酐反应得四乙酰扁柏双黄酮氧代丁酸，经EDCl，NHS作用得中间体化合物6，化合物6与氨基糖反应得酰胺7，经甲醇钠作用脱除乙酰基保护得到目标产物WG020；即如下：3.如权利要求2所述的扁柏双黄酮衍生物WG020的制备方法，其特征在于，具体步骤为：(1)精密称取扁柏双黄酮，加入乙腈溶解，待完全溶解后加入TBSCl和咪唑，室温反应1h，用饱和氯化铵溶液猝灭反应。用二氯甲烷萃取3次，合并萃取液，用无水硫酸钠干燥，浓缩后经硅胶柱层析(...

【专利技术属性】
技术研发人员：王刚，李新民，杨家强，蒋永梅，罗秦美，李晓飞，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州,52