调节Ras泛素化的方法技术

本发明专利技术属于生物医药领域，涉及E3泛素连接酶Nedd4‑1在制备抑制Ras蛋白水平的药物中的用途。本发明专利技术还涉及在制备预防和/或治疗肿瘤的药物或者延长有机体寿命的药物中的用途。本发明专利技术实现了可以将Nedd4‑1作为靶点来开发药物用来抑制Ras蛋白水平，克服了现有技术中直接以Ras为药物靶点而存在的困难，具有良好的应用前景。

Methods for regulating ubiquitination of Ras

The invention belongs to the field of biomedicine and relates to the use of E3 ubiquitin ligase Nedd4_1 in the preparation of drugs for inhibiting Ras protein level. The present invention also relates to the use in the preparation of drugs for the prevention and/or treatment of tumors or for prolonging the life span of organisms. The invention realizes that Nedd 4_1 can be used as a target to develop drugs to inhibit Ras protein level, overcomes the difficulty of directly taking Ras as a drug target in the prior art, and has a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
调节Ras泛素化的方法
本专利技术属于生物
，涉及通过E3泛素连接酶Nedd4-1调节Ras的泛素化的方法。
技术介绍
Ras蛋白作为细胞内的分子开关，转换于结合GDP(guanosinediphosphate)的非活性状态和结合GTP(guanosinetriphosphate)的活性状态之间，在细胞内众多的生理生化调节过程中起着关键作用，包括基因表达、细胞的生长与分化、细胞周期、细胞骨架和细胞迁移、膜泡运输、细胞核与细胞质之间的运输等方面的调控。GTP的结合会让Ras蛋白的多个残基(主要是位于switchl区域的残基30-40以及位于switchll区域的残基60-70)形成一种允许Ras的效应蛋白与之结合的构象，Ras蛋白在活性状态和非活性状态之间的转化是通过GAPs(GTPase活化蛋白)和GEFs(鸟苷单磷酸酯交换因子)来调节的。Ras基因突变会导致Ras蛋白固有的GAPase活性损伤或阻止GAP与之结合，从而导致下游信号通路持续激活，促进肿瘤的发生发展。同时，Ras蛋白(包括H-Ras、K-Ras以及N-Ras)也是人类中最常见的原癌蛋白，与肿瘤生长与转化活性密切相关。人类全部肿瘤的20％-30％中发现有Ras基因突变，其中90％的胰腺癌、50％的结肠癌、30％的肺癌、50％的甲状腺癌和30％骨髓性白血病等都有Ras基因的点突变，研究表明多种肿瘤都依赖于Ras蛋白在细胞水平以及动物模型中的持续性表达。因此，关于Ras家族蛋白的研究一直受到了研究者们极大的关注。Nedd4-1是属于HECT家族的一种E3泛素连接酶，结构上包括：N端的C2结构域、中间的WW结构域和C端的HECT结构域，其具有NCBI蛋白数据库Accession：NP_006145所示的氨基酸序列。该因子能够泛素化降解Ras蛋白。蛋白质分子的泛素化是细胞内蛋白质翻译后的一种重要的共价修饰，它调控包括蛋白质分子的降解、DNA修复、基因转录、细胞周期、细胞内吞等许多重要的生物学功能。泛素化修饰介导的蛋白质降解在维持细胞的正常的生物学功能上具有极其重要的作用，非正常的蛋白质降解会引发包括癌症在内的许多疾病。近年来的一些研究结果表明，通过抑制蛋白酶复合体的活性对于一些疾病如癌症、自身免疫性疾病、炎症以及心血管疾病等都具有一定的疗效。目前Bortezomib等蛋白酶体抑制剂已被美国FDA批准应用于临床肿瘤的治疗，用于治疗多发性骨髓瘤等恶性肿瘤。然而，由于蛋白酶复合体抑制剂非特异性地影响了几乎所有的蛋白质的降解，不可避免地造成了较强的毒副作用，使得其应用受到了很大的限制。
技术实现思路
在一方面，本专利技术涉及鉴定调节Ras水平的化合物的方法，所述方法包括：a、使表达Ras的细胞或体外泛素化体系与测试化合物接触；b、选择可以增加或者降低步骤a中细胞或体系的Ras水平的化合物。任选地，所述方法还包括：c、检测步骤b中获得的化合物调节Ras水平是否依赖于Nedd4-1蛋白的存在；d、选择依赖于Nedd4-1蛋白的存在调节Ras水平的化合物。根据前述方法，其中所述表达Ras的细胞是表达外源Ras或内源Ras或两者的细胞。根据前述任一项的方法，其中所述步骤b中选择可以降低步骤a中细胞或体系的Ras水平的化合物。在另一方面，本专利技术涉及采用前述任一项的方法筛选得到的化合物。根据前述化合物，其中所述化合物能够以Nedd4-1蛋白依赖性(即所述化合物在Nedd4-1蛋白存在的基础上可以促进Ras蛋白降解，而当没有Nedd4-1蛋白存在时，所述化合物促进Ras蛋白降解的能力会明显减弱)的方式促进Ras泛素化降解。根据前述化合物，所述化合物选自：优选为：在一方面本专利技术涉及一种调节细胞内Ras水平的方法，所述方法包括：a、使调节Ras泛素化降解的化合物与表达Ras的细胞或体外泛素化体系接触；b、任选地，还调节细胞或体系中Nedd4-1的水平。根据前述的方法，所述调节Nedd4-1的水平包括：a、基因编辑，b、过表达，c、RNA干扰。根据前述任一项的方法，其中所述Ras是H-Ras、K-Ras或N-Ras及其各种突变体。根据前述任一项的方法，其中所述调节Ras泛素化降解的化合物是根据前述任一项的化合物。根据前述任一项的方法，所述化合物调节Ras泛素化降解的活性是Nedd4-1依赖性或非依赖性的。在一方面本专利技术涉及调节Ras水平的方法，所述方法包括：a、判断Ras蛋白的状态；b、如果Ras蛋白是野生型蛋白或非活性状态，则通过调节Nedd4-1的表达水平来调节Ras的水平；c、如果Ras蛋白是突变体蛋白或活性状态，则通过添加化合物来调节Ras的水平。d、任选地，所述调节Nedd4-1的表达水平和添加化合物可以同时进行。在一方面本专利技术涉及调节Ras水平的方法，所述方法包括：a、判断Ras水平是否可以被Nedd4-1调节；b、如果Ras水平可以被Nedd4-1调节，则通过调节Nedd4-1的表达水平来调节Ras的水平；c、如果Ras水平不可以被Nedd4-1调节，则通过添加化合物来调节Ras的水平。d、任选地，所述调节Nedd4-1的表达水平和添加化合物可以同时进行。根据前述任一项的的方法，其中通过上调Nedd4-1的水平来降低Ras水平，或者通过下调Nedd4-1的水平来增加Ras水平。根据前述任一项的的方法，其中通过添加化合物降低Ras蛋白的水平，优选降低Ras蛋白的水平但不影响Ras的mRNA水平。在一方面，本专利技术涉及鉴定预防或治疗癌症或肿瘤的化合物的方法，所述方法包括：a、在体外使肿瘤细胞系与本专利技术的化合物接触，任选地，所述癌症或肿瘤是Ras阳性遗传背景，b、选择能够抑制或降低所述细胞集落形成能力的化合物作为候选药物。在本专利技术的一个实施方案中，如果该待测药物能够抑制或降低癌细胞集落形成能力，则可以作为候选药物。根据前述任一项的方法，所述方法是在体外进行的。根据前述任一项的方法，所述方法是在体内进行的。在一方面，本专利技术涉及预防或治疗癌症或肿瘤的方法，所述方法包括，对患有癌症或肿瘤的对象或者对癌症或肿瘤高风险的对象施用促进Ras泛素化降解的化合物，任选地，采用本专利技术前述任一项的方法筛选鉴定促进Ras泛素化降解的化合物。任选地，所述癌症或肿瘤是Ras阳性遗传背景。根据前述任一项的方法，其中所述Ras是H-Ras、K-Ras或N-Ras及其各种活性突变体，包括但不限于G12V,G12D,G13V,G13D,Q61R。优选所述突变体是H-Ras的G12V,G13D,Q61R；K-Ras的G12V,G12D,G13V,G13D,Q61R；N-Ras的G12V,G13V,G13D,Q61R。最优选所述突变体是K-Ras的G12V。在一方面，本专利技术涉及调节Nedd4-1的表达水平的化合物在制备用于预防或治疗癌症或肿瘤的药物中的用途。所述调节Nedd4-1的表达水平的化合物包括但不限于，核酸构建体，小分子化合物，抗体等。在一方面，本专利技术涉及促进Ras蛋白泛素化降解的化合物在制备用于预防或治疗癌症或肿瘤的药物中的用途，优选所述促进Ras蛋白泛素化降解的化合物是Nedd4-1依赖性的，任选地，所述化合物是根据前述任一项的化合物。在一方面，本专利技术涉及促进Ras蛋白泛素化降解的化合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.鉴定调节Ras水平的化合物的方法，所述方法包括：a、使表达Ras的细胞或体外泛素化体系与测试化合物接触；b、选择可以增加或者降低步骤a中细胞或体系的Ras水平的化合物，优选选择可以降低步骤a中细胞或体系的Ras水平的化合物；任选地，所述方法还包括：c、检测步骤b中获得的化合物调节Ras水平是否依赖于Nedd4‑1蛋白的存在；d、选择依赖于Nedd4‑1蛋白的存在调节Ras水平的化合物。

【技术特征摘要】
1.鉴定调节Ras水平的化合物的方法，所述方法包括：a、使表达Ras的细胞或体外泛素化体系与测试化合物接触；b、选择可以增加或者降低步骤a中细胞或体系的Ras水平的化合物，优选选择可以降低步骤a中细胞或体系的Ras水平的化合物；任选地，所述方法还包括：c、检测步骤b中获得的化合物调节Ras水平是否依赖于Nedd4-1蛋白的存在；d、选择依赖于Nedd4-1蛋白的存在调节Ras水平的化合物。2.根据权利要求1的方法，其中所述表达Ras的细胞或体系是表达外源Ras或内源Ras或同时表达两者的细胞或体系。3.一种调节细胞内Ras水平的方法，所述方法包括：a、使调节Ras泛素化降解的化合物与表达Ras的细胞或体外泛素化体系接触，任选地，所述化合物调节Ras泛素化降解的活性是Nedd4-1依赖性或非依赖性的；b、任选地，还调节细胞中Nedd4-1的水平，任选地，所述调节Nedd4-1的水平包括：a、基因编辑，b、过表达，c、RNA干扰，d、小分子化合物，e、抗体。4.调节Ras水平的方法，所述方法包括：a、判断Ras蛋白的状态；b、如果Ras蛋白是野生型蛋白或非活性状态，则通过调节Nedd4-1的表达水平来调节Ras的水平；c、如果Ras蛋白是突变体蛋白或活性状态，则通过添加化合物来调节Ras的水平；任选地，所述调节Nedd4-1的表达水平和添加化合物可以同时进行；任选地，通过上调Nedd4-1的水平来降低Ras水平，或者通过下调Nedd4-1的水平来增加Ras水平；任选地，其中通过添加化合物降低Ras蛋白的水平但是不影响Ras的mRNA水平。5.根据前述权利要求任...

【专利技术属性】
技术研发人员：王洪睿，邓贤明，曾涛玲，姜婷婷，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建,35