细胞复刻表面及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种细胞复刻表面及其应用，是可以用于血液中稀有细胞高纯度捕获的与模板细胞结构互补的微纳拓扑结构表面，在其表面还可以修饰有稀有细胞特异性识别抗体，在两者的协同作用下可实现稀有细胞的高效特异性捕获。本发明专利技术所述细胞复刻表面的制作工艺简单、制备成本低廉、其对稀有细胞有很高的捕获效率，并且特异性能优越，还具有不同稀有细胞类型的广谱捕获性。特别适用于捕获富集病人体内的稀有细胞，尤其是循环肿瘤细胞，对癌症预后、早期诊断、疗效评估、复发预测以及个体化治疗等都有着重要的指导作用。

Cell surface and its application

The invention provides a cell replica surface and its application, a micro-nano topological surface which can be used for high purity capture of rare cells in blood and complementary to the template cell structure, and a rare cell specific recognition antibody can be modified on the surface of the micro-nano topological surface, and the high efficiency and specificity of rare cells can be realized under the synergistic action of the two. Sexual capture. The cell replica surface of the invention has the advantages of simple preparation process, low preparation cost, high capture efficiency for rare cells, superior specificity and broad-spectrum capture for different rare cell types. Especially suitable for the capture and enrichment of rare cells in patients, especially circulating tumor cells, cancer prognosis, early diagnosis, efficacy evaluation, recurrence prediction and individualized treatment has an important guiding role.

【技术实现步骤摘要】
细胞复刻表面及其应用
本专利技术属于生物功能材料、分析检测
，特别涉及在材料表面形成细胞复刻表面，并用于捕获血液中稀有细胞，尤其是循环肿瘤细胞的技术。
技术介绍
血液中一些细胞的含量非常少，但是对于理解疾病很重要，比如干细胞、循环内皮细胞、残留病变细胞和循环肿瘤细胞。准确检测和分析这些稀有细胞，对理解疾病进程和发病机制非常关键，尤其是循环肿瘤细胞与癌症早期诊断密切相关。研究表明90％的癌症死亡是由癌症转移引起的，循环肿瘤细胞(CTCs)是指从实体肿瘤病灶脱落，发生上皮-间质转化(EMT)后具有流动特性而进入外周血的肿瘤细胞。CTCs与癌症转移密切相关，因此直接从血液中捕获CTCs是一种微创性的检测手段，可以对化疗效果深入了解并能实现癌症的早期诊断。近年来，CTCs捕获技术主要分为物理法和生物化学法。物理法主要是利用癌细胞与正常血细胞在尺寸、密度等方面的差异对癌细胞进行分离。生物化学法基于免疫识别分离的原理，目前主要以上皮细胞粘附分子抗体(Anti-EpCAM)或核酸适配体为识别分子，磁性纳米颗粒或微流控芯片为载体实现对CTCs的捕获。虽然这些方法都具有一定的CTCs捕获效果，但也存在着各种不足。文献Small2015,11,3850、Angew.Chem.Int.Ed.2016,55,1252、Chem.Soc.Rev.,2017,46,4245综述了近年来CTCs捕获的方法和技术，也提出了一些存在的问题。如物理法分离纯度低；磁珠法操作复杂、不具备广谱性；微流控芯片制备成本高、细胞富集时间较长等。此外，中国专利CN201610760765.4、CN201380075303.3、CN201580022705.6中报道的CTCs捕获技术也很难克服上述的问题。微纳米结构具有高比表面积和生物相容性，在不同的微纳米拓扑结构中，细胞表面形态作为多尺度、复杂且自然的微纳米结构，具有纳米尺度的丝状伪足和微米尺度的表面微凸体。因此，我们提出选用高分子材料，通过软刻的方法制备与模板细胞互补的微纳拓扑结构的细胞复刻表面，并将其应用于血液中稀有细胞的捕获。目前尚未有报道此种细胞复刻表面的制备方法及其应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种操作简便快捷，成本低廉并且具备高效捕获率及捕获纯度的细胞复刻表面。所述的细胞复刻表面，具有与模板细胞结构互补的微纳拓扑结构表面，所述模板细胞为具有伪足结构的组织细胞。对于上文技术方案中所述的细胞复刻表面，优选的情况下，其除了含有微纳拓扑结构表面之外，还具有修饰在此表面的稀有细胞特异性识别抗体，所述的稀有细胞特异性识别抗体为待捕获稀有细胞的特异性识别抗体，所述的待捕获稀有细胞选自干细胞、循环内皮细胞、残留病变细胞和循环肿瘤细胞。本专利技术上文所述的微纳拓扑结构表面是与模板细胞结构互补的微纳拓扑结构表面，其中，所述模板细胞为具有伪足结构的组织细胞。使得细胞复刻表面具有丰富的模板细胞丝状伪足的微纳米结构，通过微纳米结构与模板细胞的拓扑结构产生增强粘附效应，同时，辅以在其表面修饰稀有细胞特异性识别抗体，抗体特异性识别提高了待捕获细胞的捕获率并降低了血细胞的粘附。对于上文技术方案中所述的细胞复刻表面，优选的情况下，所述的待捕获稀有细胞特异性识别抗体，是通过化学偶联法或生物亲和法连接修饰在微纳拓扑结构表面上的。所述的化学偶联法或生物亲和法为生物
的常规技术。对于上文技术方案中所述的细胞复刻表面，优选的情况下，所述的微纳拓扑结构表面的制备方法包括以下步骤：将上文所述的模板细胞接种在细胞培养面进行增殖培养(其中，所述的细胞培养面通常为细胞培养基形成的平面)；所得的模板细胞通过多聚甲醛、丙酮、甲醇或戊二醛将模板细胞固定在细胞培养面上，并使模板细胞脱水收缩，再将高分子预聚物浇筑在模板细胞表面，高分子预聚物热固交联固化后，将其剥离得到微纳拓扑结构表面；将所的微纳拓扑结构表面通过化学偶联法或生物亲和法连接上稀有细胞特异性识别的抗体获得终产品——细胞复刻表面，可以广泛用于从血液中高效捕获目标的稀有细胞。对于上文技术方案中所述的细胞复刻表面，优选的情况下，所述的制备方法中通过无水乙醇、无水结晶盐、多羟基化合物等脱水使模板细胞脱水收缩，从而得到更加坚硬、粗糙的表面结构。对于上文技术方案中所述的细胞复刻表面，优选的情况下，所述的微纳拓扑结构表面是通过软刻的方法或细胞印记的方法得到与模板细胞结构互补的微纳拓扑结构。所述软刻的方法是通过高分子预聚物浇筑在模板细胞表面，热固交联固化后，剥离得到细胞复刻表面。所述传统软刻技术中的模板材料通常选用光刻法制备的人造图案化模板，而很少使用天然生物表面(例如哺乳动物细胞，微生物等材料)的原因在于：天然生物表面不够坚硬，且含水量丰富的表面在软刻法制备过程中不易得到与模板材料互补的精细结构。为了克服上述技术问题，本专利技术创新的提出通过多聚甲醛、丙酮、甲醇或戊二醛将模板细胞固定在细胞培养皿或类似其他的细胞培养面上，并通过无水乙醇、无水结晶盐、多羟基化合物等脱水使细胞收缩，从而得到坚硬粗糙的模板细胞表面，这样就可以使用高分子材料软刻制备模板细胞复刻表面。对于上文技术方案中所述的细胞复刻表面，优选的情况下，所述的微纳拓扑结构表面的材料为高分子材料，一般选自聚二甲基硅烷、过氧化聚吡咯和聚氨酯。对于上文技术方案中所述的细胞复刻表面，优选的情况下，所述模板细胞选自癌细胞、组织细胞、白细胞和吞噬细胞。对于上文技术方案中所述的细胞复刻表面，优选的情况下，所述的与模板细胞互补的微纳拓扑结构所占面积不低于总面积的65％。本专利技术的另一方面在于保护上文所述的细胞复刻表面在高效捕获血液中稀有细胞中的应用。本专利技术通过选用高分子材料，由软刻技术来制备不同基底形貌的细胞复刻表面，在细胞复刻表面上连接待捕获的稀有细胞(实施例中主要以癌细胞为例)表面特异性识别的抗体。在细胞复刻表面拓扑作用与抗体特异性识别作用的协同下实现了对稀有细胞的高效特异性捕获。并且在全血中也达到较高的捕获率及捕获纯度，为之后的临床应用提供了可能。实验结果表明，本专利技术的细胞复刻表面对待捕获的稀有细胞能实现较高的捕获率，尤其是实施例中以癌细胞为例，其捕获率能达到73％，修饰特异性的抗体后，对抗体阳性癌细胞的捕获率可达到90％，对抗体阴性癌细胞的捕获率亦可达到72％，具有癌细胞广谱捕获能力。抗体修饰的细胞复刻表面对癌细胞的粘附性及特异性能优越，痕量CTCs人造血样的捕获效率可达85％，捕获纯度可达90％以上。有益效果：本专利技术公开一种用于血液中稀有细胞捕获的细胞复刻表面，其制备方法简单、制备成本低廉，在具体的应用实例中也表现出对稀有细胞的高捕获率，并且特异性能优越，在全血中也表现出稀有细胞高效捕获率及捕获纯度。本专利技术特别适用于捕获富集病人体内的稀有细胞，尤其是循环肿瘤细胞，对癌症预后、早期诊断、疗效评估、复发预测以及个体化治疗等都有着重要的指导作用。附图说明图1为本专利技术实施例1制备的细胞复刻表面的扫描电镜照片，比例尺为1μm。图2为本专利技术实施例1的细胞复刻表面和平面表面共聚焦显微镜的照片。其中A为平面表面的三维形貌图片；B为细胞复刻表面的三维形貌图片。图3为本专利技术实施例1的细胞复刻表面和平面表面对癌细胞的捕获效率柱状图。图4为本专利技术实施例2的抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞复刻表面，其特征在于，具有与模板细胞结构互补的微纳拓扑结构表面，所述模板细胞为具有伪足结构的组织细胞。

【技术特征摘要】
1.一种细胞复刻表面，其特征在于，具有与模板细胞结构互补的微纳拓扑结构表面，所述模板细胞为具有伪足结构的组织细胞。2.根据权利要求1所述的细胞复刻表面，其特征在于，所述的微纳拓扑结构表面还修饰有待捕获的稀有细胞特异性识别抗体，所述的待捕获的稀有细胞选自干细胞、循环内皮细胞、残留病变细胞和循环肿瘤细胞。3.根据权利要求1所述的细胞复刻表面，其特征在于，所述的待捕获的稀有细胞特异性识别抗体，是通过化学偶联法或生物亲和法连接修饰在微纳拓扑结构表面上。4.根据权利要求1或2所述的细胞复刻表面，其特征在于，所述的微纳拓扑结构表面的制备方法包括以下步骤：通过多聚甲醛、丙酮、甲醇或戊二醛将模板细胞固定在细胞培养面上，并使模板细胞脱水收缩，将高分子预聚物浇筑在模板细胞表面，高分子预聚物热固交联固化...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩璐璐，贾凌云，孙贺，杨立为，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21